Determinación de zona óptica transversal muscular de los músculos de vuelo indirectos adultos de Drosophila Melanogaster
Summary
Se presenta un método para cuantificar el área del músculo, que es un método indirecto para determinar la masa muscular en adultos del Drosophila . Demostramos la aplicación de nuestra metodología, analizando el vuelo indirecto los músculos en un modelo de Drosophila de la enfermedad de la distrofia miotónica.
Abstract
Masa muscular atrofia, atrofia muscular, es un fenotipo común en modelos de Drosophila de enfermedades neuromusculares. Hemos utilizado los músculos de vuelo indirectos (IFMs) de las moscas, específicamente los músculos dorso-longitudinales (DLM), como el experimental sujeto a medida el fenotipo atrófico provocado por diferentes causas genéticas. En este protocolo, se describe cómo incrustar los músculos tórax mosca para seccionar fino semi, cómo obtener un buen contraste entre el músculo y el tejido circundante y cómo procesar imágenes de microscopio óptico para semiautomática adquisición de datos cuantificables y Análisis. Se describen tres aplicaciones específicas de la tubería metodológica. En primer lugar, mostramos cómo se puede aplicar el método para cuantificar la degeneración del músculo en un modelo de mosca de la distrofia miotónica; en segundo lugar, la medición del área transversal del músculo puede ayudar a identificar genes que promoverán o evitar la atrofia muscular o degeneración muscular; en tercer lugar, este protocolo puede ser aplicado para determinar si un compuesto candidato es capaz de modificar de manera significativa un determinado fenotipo atrófico inducido por una mutación enfermedad-que causano por un disparador ambiental.
Introduction
El tórax de la mosca de la fruta contiene dos clases diferentes de los músculos de vuelo, que son funcionalmente, fisiológicamente y anatómicamente distintas. Estos músculos son: controlan de los músculos de vuelo indirectos (IFM), que se componen de dorso-longitudinales (DLM) y los músculos dorso-ventral (DVM) (figura 1) y el vuelo síncrono músculos1,2. Juntos, estos músculos generan la elevada potencia mecánica requerida para el vuelo. El tamaño, distribución y disposición rostro caudal de las IFMs permiten una fácil orientación para seccionamiento transversal3 (figura 2A). Por esta razón, hemos seleccionado estos músculos para el estudio de la atrofia muscular en Drosophila melanogaster.
Figura 1. Diagrama del tórax de la mosca de la fruta que muestra los músculos de vuelo indirectos (IFMs) arreglo. (Izquierda) representa una visión lateral y (derecha) representa un corte transversal del tórax. El IFMs se componen de los músculos Dorso-longitudinales (DLM) (en rojo) y Dorso-ventral (DVM) de los músculos (en verde).
Preservación de la estructura del tejido y el control sobre la orientación del eje dorso-ventral de las secciones histológicas son críticos para garantizar la correcta evaluación de área transversal del músculo. Para preservar la estructura muscular se utilizó una mezcla de fijación modificada de Tomlinson et al. 4 . Por otra parte, porque los músculos son los tejidos internos, la impermeabilidad del exoesqueleto de Drosophilaes un problema como fijación mezclas no pueden penetrar a los tejidos de destino. Para evitar este problema, hemos eliminado la cabeza volar, patas, alas y los dos últimos segmentos del abdomen para crear agujeros que permiten la mezcla de fijación entrar. Como parte del Protocolo de fijación que se incluyeron tratamiento con tetróxido de osmio (OsO4)5, que utiliza extensivamente debido a su capacidad para fijar las grasas, incluyendo triglicéridos. OsO4 conserva la mayoría de las estructuras muy bien, especialmente a nivel citológico y al mismo tiempo proporciona contraste a la imagen. Después de la fijación, Drosophila toracico fueron embebida en resina para transversal semi-delgadas seccionamiento (1,5 μm). Para mejor contraste, tejido puede ser además teñido con toluidina azul. Imágenes de toracico completo se tomaron 10 X y área del músculo se cuantificó por binarizing imágenes (de dimensiones iguales) y cuantificar el porcentaje de píxeles correspondiente a tejido muscular (pixeles negros) de total, con el software ImageJ.
Modificaciones en las mezclas de preparación y fijación de tejidos, como el aumento de la concentración de OsO4 glutaraldehído solución, en este protocolo, permitieron la única preservación del tejido muscular. Esto es porque el protocolo evita la degradación y deformación del tejido, haciendo el análisis posterior de las muestras más confiable incluso en condiciones altamente atróficas asociadas a enfermedades degenerativas NEUROMUSCULARES como la distrofia miotónica (DM). En su forma más común, DM tipo 1, este trastorno genético poco común es provocada por repeticiones CUG ampliadas en las transcripciones de la proteína quinasa de distrofia miotónica (DMPK). Agregados de ARN mutante de DMPK focos de ribonuclear de forma que secuestran las proteínas de unión a RNA nucleares Muscleblind-como (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) en Drosophila)6. Hemos generado un modelo de Drosophila de la distrofia Myotonic expresando 250 repeticiones CTG en el promotor de la cadena pesada de miosina muscular (Mhc-Gal4). Moscas modelo eran incapaces de volar con un fenotipo típico ‘celebró hasta las alas’ y tenían graves musculares atrofia en sus IFMs (figura 2B). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que la determinación de la zona muscular de IFMs es un método fiable para cuantificar los efectos de diferentes modificadores químicos o genéticos de la atrofia muscular en estas moscas modelo del7. Por ejemplo, la sobreexpresión de la isoforma de la Mbl C en moscas expresando la CTG 250 repeticiones en el músculo, consigue un rescate del área del músculo, como agotamiento de Mbl por secuestro es el factor desencadenante en la patogenesia de DM18 (figura 2). Área del músculo también fue rescatado después de alimentar el modelo DM vuela con Abp1, un hexapéptido con anti-DM1 probada actividad9 (Figura 2D).
Figura 2. Cuantificación de secciones dorsoventral de toracico adulto embebido en resina. Los músculos de vuelo indirectos (A-d) de Drosophila melanogaster con los genotipos correspondientes indicados. (A) control de moscas (PA). (B) expresión de 250 CTG no codificante se repite en el músculo (UAS-CTG(250)x) provocó una reducción del área del músculo en el DLMs en comparación con el control de moscas. (C) este fenotipo de atrofia muscular fue rescatado por la sobreexpresión de Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS MblC) y (D) alimentación las moscas modelo con hexapéptido Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). En todas las imágenes el lado dorsal es en la parte superior. Los transgenes fueron conducidos a los músculos mediante un promotor de la cadena pesada de miosina (Mhc)-Gal4. E cuantificación del porcentaje de área muscular en relación con las moscas de control confirma que las diferencias fueron significativas. El histograma muestra los medios ± SEM **p< 0.01 y * p < 0.05 (prueba de t de Student´s). Barra de escala: 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El método aquí registrado serán de interés a los investigadores centrarse en desarrollo muscular, mantenimiento y envejecimiento, patología de la enfermedad y las pruebas de drogas ya que proporciona información confiable sobre cómo el tejido muscular responde a factores endógenos y externos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se ha demostrado que la Drosophila melanogaster es un modelo útil para estudiar enfermedades neuromusculares humanas7,10,11, incluyendo distrofias miotónica, que se caracterizan por la aparición de atrofia muscular. El protocolo presentado aquí es una herramienta útil para la cuantificación de la degeneración muscular causada por la aparición o progresión de una enfermedad particular en un modelo de mosca. Por …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los miembros del grupo de genómica traslacional y Kathryn J Hanson para el feed-back y las mejoras de este protocolo. Este proyecto fue realizado con la beca de investigación SAF2015-64500-R, que incluye fondos europeos de Desarrollo Regional, otorgado a R.A por el Ministerio de Economia y Competitividad.
Materials
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
Riferimenti
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