Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch
Summary
Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die ganze Transkriptom-Analyse von Zebrafisch-Embryonen, Larven, oder Zellen sortiert. Wir gehören Isolierung von RNA, Pathway-Analyse von RNASeq Daten und qRT-PCR-basierte Validierung von Veränderungen der Genexpression.
Abstract
Die Analyse der Veränderungen der globalen Genexpression ist ein wertvolles Instrument zur Identifizierung von neuartige Wege beobachteten Phänotypen zugrunde liegen. Der Zebrabärbling ist ein hervorragendes Modell für schnelle Beurteilung der ganze Transkriptom vom ganzen Tier oder einzelne Zellpopulationen wegen der Leichtigkeit der Isolierung der RNA aus große Zahl von Tieren. Hier ist ein Protokoll für globale gen Expressionsanalyse in den Zebrafish Embryos mit RNA Sequenzierung (RNASeq) vorgestellt. Wir beschreiben Vorbereitung der RNA aus ganzen Embryonen oder Zell-Populationen mit Zelle Sortierung bei transgenen Tieren erzielt. Wir beschreiben auch einen Ansatz zur Analyse von RNASeq Daten, angereicherte Wege und Gene Ontology (gehen Sie) Begriffe im globalen gen Ausdruck Datensätze zu identifizieren. Zu guter Letzt bieten wir ein Protokoll für die Validierung von Veränderungen der Genexpression mit quantitative Reverse Transkriptase PCR (qRT-PCR). Diese Protokolle können für die vergleichende Analyse der Steuerung und experimentellen Gruppen von Zebrafisch verwendet werden, um Veränderungen der neuartigen Genexpression zu identifizieren und molekulare Einblick in Phänotypen von Interesse.
Introduction
Vergleichende Analyse der globalen Genexpression ist ein wertvolles Werkzeug, neuartige Gene zur beobachteten Phänotypen zu identifizieren. Solche Analysen in der Regel verlassen sich auf quantitative Bewertung der Abschrift Fülle im Vergleich zwischen experimentellen und Kontrollproben. Gezielte Ansätze, wie z. B. qRT-PCR sind relativ schnelle und genaue Untersuchung der Veränderungen der einzelnen Genexpression. RNA-Sequenzierung (RNASeq) bietet einen breiten, Hypothese-freie Ansatz um wesentliche Änderungen in der Genexpression zwischen Proben, so dass es nun den Standard für solche Untersuchungen über experimentelle Systeme zu identifizieren.
Zebrafisch entstanden als prominente Modell in vielen Bereichen der Krankheit. Ursprünglich entwickelt für ihre Nützlichkeit in Entwicklungsbiologie Studien aufgrund ihrer hohen Fruchtbarkeit und relativ geringen Kosten für Wartung, experimentellen Einsatz von Zebrafisch entwickelt hat, um umfassen eine Vielzahl von Phänotypen aus embryonalen bis adulten Stadien als auch als ein Vielzahl von molekularen Tests1,2,3. In der Tat, diese Vorteile machen die molekularen mechanistische Studien schnelle und kostengünstige wegen der Leichtigkeit des Erwerbs von großen Mengen an Material kombiniert mit der Leichtigkeit des genetischen und umweltbedingten Manipulation in allen Phasen des Lebens. Darüber hinaus die transparente Art der Zebrafisch-Embryonen und Larven machen es ideal für die Erzeugung von Zell- und gewebespezifische transgenen Reporter Linien in Vivo Visualisierung von diskreten Zelle Bevölkerungen4ermöglicht. Ausbeutung von solchen Linien ermöglicht globale gen Expressionsanalyse in bestimmten isolierten Zelle Arten basierend auf Reporter-gen-Expression.
Hier präsentieren wir Ihnen ein umfassendes Protokoll für globale Genanalyse Ausdruck mit RNASeq nach der Kultur der Zebrafisch-Embryonen. Genetischen experimentelle Manipulationen, einschließlich Morpholino (MO)-aufgrund vorübergehender gen-Knockdown oder CRISPR-vermittelten Genom-Bearbeitung, wurden präsentiert an anderer Stelle5,6,7. Wir daher konzentrieren sich auf ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus ganzen Embryonen oder transgene Reporter exprimierenden Zellen, gefolgt von einfachen numerischen Analyse der RNASeq Ergebnisse mit Weg-Tools und gen Ontology (gehen Sie) Begriffe sortiert. Zu guter Letzt haben wir eine Strategie für die Validierung von Veränderungen der Genexpression durch quantitative Reverse Transkriptase PCR (qRT-PCR) aufgenommen. Diese Protokolle sind für Zebrafisch-Embryonen, die eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen, auch im Vergleich der genetische Mutanten oder Umweltbedingungen ausgesetzt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschriebene Ansatz bietet eine relativ schnelle und kostengünstige Strategie für Transkriptom-Level-Analyse der ganze Tiere oder bestimmte sortierte Zellpopulationen. Der Zebrabärbling bietet eine vorteilhafte Modell für diese Art der Studie wegen der Leichtigkeit und Schnelligkeit beim generieren großer Mengen an Material, die einfache Implementierung von genetischen oder experimentelle Umweltbedingungen und die Verfügbarkeit eines großen ab Spektrum an transgenen Reporter Linien zur Isolatio…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) und T32DK098107 (T.L.H. und J.E.N).
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
Riferimenti
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