면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 포 르 말린 고정 뇌 조직에 배경 형광의 간단한 제거
Summary
생물 학적 샘플의 배경 autofluorescence는 종종 형광 기반 이미징 기술을, 특히 세 인간의 postmitotic 조직에에서 복잡. 이 프로토콜에 설명 합니다이 예제에서 autofluorescence를 효과적으로 제거 될 수 있다 어떻게 photobleach immunostaining 이전 샘플 소스를 상업적으로 사용할 수 있는 발광 다이오드 빛을 사용 하 여.
Abstract
면역 형광 검사 subcellular 구획을 시각화 하 고 조직 샘플 내 특정 단백질의 지 방화를 결정 하는 데 사용 하는 일반적인 방법입니다. 면역 형광 이미지를 높은 품질의 인수에 큰 방해 lipofuscin 같은 노화 안료 또는 알데하이드 고정 등 일반적인 샘플 준비 과정에 의해 발생 하는 조직의 내 생 autofluorescence입니다. 이 프로토콜 배경 형광을 흰색 형광체 발광 다이오드 (LED) 배열 처리 이전 형광 프로브를 사용 하 여 photobleaching를 통해 크게 줄어들 수 있습니다 방법에 대해 설명 합니다. 흰색 형광체의 넓 스펙트럼 방출 Led 방출 봉우리의 범위에 걸쳐 fluorophores의 표백에 대 한 수 있습니다. Photobleaching 장치 매우 낮은 비용에 상용 구성 요소에서 생성 될 수 있습니다 고 상용 화학 quenchers에 액세스할 수 있는 대안을 제공 합니다. 뒤에 기존의 면역 형광 염색 직물의 photobleaching 전처리 배경 autofluorescence의 이미지를 생성 합니다. 비교 조사 배경 감소는 화학 quenchers 설립을 신호, photobleaching 처리 했다 프로브 형광 강도에 영향을 주지 않습니다 그것은 배경과 lipofuscin 형광을 효과적으로 감소 하는 동안. Photobleaching 전처리에 대 한 더 많은 시간을 필요로, 하지만 높은 휘도 LED 배열 photobleaching 시간을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다. 이 간단한 방법은 잠재적으로 다양 한 조직, 두뇌 등 lipofuscin 축적 특히 postmitotic 조직 및 심장 또는 골격 근육에 적용할 수 있습니다.
Introduction
형광 현미경 검사 법 특정 단백질을 표적으로 하는 항 체를 사용 하 여 정기적으로 세포 배양과 조직에 관심사의 단백질을 시각화 하는 데 사용 됩니다. 면역 형광 검사에서 명확 하 고 확실 한 이미지의 인수를 주요 합병증이 발생할 수 있습니다 endogenously 포유류 조직에서 나이 안료 lipofuscin과 단백질 엘라 스 틴과 콜라겐1, autofluorescence 2. Autofluorescence의 다른 소스는 알데하이드 고정3샘플 준비 단계를 통해 소개 될 수 있습니다. Lipofuscin과 립, oxidatively 수정 단백질과 지질 저하 잔류물의 주로 구성 된 긴 살아있는 세포 증가 나이2에 누적 됩니다. 그러면 뇌와 심장이 나 골격 근육, postmitotic 조직 이미징에 어려움 lipofuscin의 형광 방출 스펙트럼은 광범위 하 고 가변, 자주 사용 하는 일반적인 fluorophores의 방출 파장와 동시 4라벨. 이러한 요인 특히 도전 frontotemporal lobar 변성 (FTLD) 늦은 발병 신경 퇴행 성 질병의 경우에서 인간 뇌 조직의 이미지를 확인 합니다.
Autofluorescence를 줄이기 위해, 우리는 우리와 백색 발광 다이오드 (LED) 배열 가구 책상 램프5를 사용 하 여 슬라이드 마운트 조직 단면도 비추는 기법을 고안 했다. 이 간단한 기술은 대안을 암모늄 아세테이트, 또는 냉각 하는 염료 수단 블랙 B 및 Eriochrome 블랙 T6같은 상용 CuSO4 등 화학 quenchers를 사용 하는 기법을 제공 합니다. 그것은 또한 상당한 비용 절약 이상의 multispectral 있다 램프 photobleaching 기술을 주도하 고 합병증과 스펙트럼 취소 혼합7,8같은 디지털 autofluorescence 제거 방법에서 생성 하는 유물을 피 한다. 백색 발광 Led 있다 넓은 방출 스펙트럼, 높은 광도 및 낮은 제조 비용, photobleaching chromophores5,9다양 한에 대 한 상용 부품으로 이상적.
이 프로토콜에 액세스할 수 있는 구성 요소를 사용 하 여 photobleaching 기구 건설을 설명 하 고 FTLD 조직의 phosphorylated 타우에 대 한 항 체 관련을 사용 하 여 타우-긍정적인 포함 (FTLD-T)를 포함 하는 경우에 photobleaching를 적용. 우리 붙일 표시 된 항 체 두 통용 chromophores 채용 이미징에 photobleaching의 효과 보여줍니다: 알 렉 사 488와 텍사스 레드. 치료 섹션 대 photobleaching의 효과 또는 상업적인 화학 끄는 치료는 계량 하 고 비교. 이 photobleaching 전처리 생물학 견본에서 autofluorescence를 제거 하려면 모든 표준 면역 형광 얼룩 프로토콜에 포함 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
조직의이 원고에 설명 된 photobleaching 전처리 상용 구성 요소를 사용 하 여 autofluorescence의 효과적인 제거 할 수 있습니다. 프로토콜 phosphorylated 타우 포 르 말린 고정 뇌 조직 알 렉 사 488, 핵 counterstain로 DAPI와 텍사스 적색 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 집계의 면역 형광 영상을 설명 합니다. 다른 조직에 메서드를 적용 하려면 시작 지점으로 샘플을 48 h photobleaching 사전 치료를 수행 하는 것이 좋?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 캐나다 컨소시엄 Neurodegeneration 에이징 (CCNA)는, 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR), 캐나다 (ALS 캐나다), ALS 협회와 캐나다 (ASC)의 알 츠 하이 사회에 의해 전체 또는 일부를 지원 했다. 저자 술탄 Darvesh와 해상 뇌 조직 은행에서 FTLD 뇌 조직을 제공 하기 위한 Spatio 시간적 타겟팅 및 증폭 방사선 응답 (STTARR) 프로그램와의 제휴에서 밀라노 Ganguly 앤드류 리드 감사 하 고 싶습니다. 기관 조직 포함 및 서비스, 그리고는 고급 광학 현미경 시설 (AOMF) 현미경 계기를 제공 하기 위한 단면에 대 한 자금. 케빈 해 들 리 원고의 중요 한 검토에 대 한 감사입니다.
Materials
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
Riferimenti
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