Analisi precisa, High-throughput di crescita batterica
Summary
Valutazione quantitativa della crescita batterica è essenziale per comprendere la fisiologia microbica come un fenomeno di livello dei sistemi. Un protocollo per la manipolazione sperimentale e un approccio analitico vengono introdotti, per consentire analisi precisa, ad alta velocità di crescita batterica, che è un tema chiave di interesse in biologia dei sistemi.
Abstract
Crescita batterica è un concetto centrale nello sviluppo della moderna fisiologia microbica, così come nelle indagini di dinamica cellulare a livello di sistemi. Studi recenti hanno riferito le correlazioni tra la crescita batterica e gli eventi di genoma, come riorganizzazione di riduzione e del trascrittoma di genoma. Analizzare correttamente la crescita batterica è cruciale per capire il coordinamento di crescita-dipendente delle funzioni geniche e componenti cellulari. Di conseguenza, la precisa valutazione quantitativa della crescita batterica in un modo ad alta velocità è richiesta. Gli sviluppi tecnologici emergenti offrono nuovi strumenti sperimentali che consentono aggiornamenti dei metodi utilizzati per studiare la crescita batterica. Il protocollo introdotto qui impiega un lettore di micropiastre con una procedura sperimentale altamente ottimizzata per la valutazione precisa e riproducibile di crescita batterica. Questo protocollo è stato usato per valutare la crescita di diversi ceppi di Escherichia coli in precedenza. Le fasi principali del protocollo sono come segue: la preparazione di un gran numero di cellule Stock in piccole fiale per ripetuti test con risultati riproducibili, l’uso di piastre a 96 pozzetti per valutazione di crescita ad alta velocità e il calcolo manuale delle due grandi parametri (cioè, crescita massima frequenza e densità di popolazione) che rappresenta il tasso di crescita. Rispetto ai tradizionali test di unità (CFU) formanti colonie, che conta le celle che sono coltivate in tubi di vetro nel tempo su piastre di agar, il presente metodo è più efficiente e fornisce documenti più dettagliati temporale dei cambiamenti di crescita, ma ha una più rigorosa limite di rilevabilità a bassa densità. In sintesi, il metodo descritto è vantaggioso per l’analisi di alto-rendimento preciso e riproducibile della crescita batterica, che può essere utilizzata per trarre conclusioni concettuale o effettuare osservazioni teoriche.
Introduction
Studi microbiologici spesso iniziano con la cultura delle cellule batteriche e la valutazione delle curve di crescita batterica, che rappresentano un fenomeno fondamentale della fisiologia batterica1,2,3. Principi di cultura di base sono ampiamente disponibili nella letteratura di ricerca pubblicata e libri di testo perché la coltura batterica è una metodologia fondamentale. A livello di banco, notevole attenzione è stata concentrata tradizionalmente su ottimizzando la crescita media e condizioni di coltura, ma controllando il tasso di crescita, che sarebbe probabilmente fornire anche una maggiore comprensione della fisiologia microbica, non è stato estesamente studiato4. Per i batteri in crescita esponenziale, un parametro chiave dello stato cellulare è il tasso di crescita, che è stato segnalato per essere coordinato con il genoma, trascrittoma e proteoma5,6,7,8 . Pertanto, la valutazione quantitativa della crescita batterica è cruciale per capire la fisiologia microbica.
Per valutare la crescita batterica, i metodi sperimentali usati per stimare la biomassa sono affermati9,10 e si basano sulla rilevazione di parametri biochimici, fisici o biologici, come torbidità ottico. Inoltre, i metodi analitici utilizzati per catturare le proprietà dinamiche dei cambiamenti di crescita comunemente sono basati su modelli non lineari consolidati11,12,13, ad esempio, logistiche equazioni. Tasso di crescita è generalmente acquisite mediante campionamento temporizzato della crescita delle cellule in coltura da misura della torbidità ottico o eseguire dosaggi di formanti colonie (CFU) unità. La limitazione di questi metodi di rilevamento e di coltura è che i punti dati non sono un vero riflesso della dinamica di popolazione, poiché gli intervalli di misurazione sono spesso in ore e poiché la condizione di cultura (ad esempio, variazioni di temperatura e aerazione) è disturbato al momento del campionamento. Tecniche di analisi e cultura devono essere aggiornate utilizzando recenti sviluppi nella tecnologia e nella comprensione. Gli avanzamenti recenti in lettori di micropiastre consentono l’osservazione in tempo reale di crescita batterica e ridurre notevolmente i costi di manodopera. Utilizzando questi dispositivi avanzati, gli ultimi studi sulla crescita batterica sono riportati metodi analitici per misure ad alta velocità14,15.
Lo scopo del presente protocollo è quello di valutare la dinamica di crescita precise in un modo ad alta velocità, che si riveleranno utile per studi quantitativi che, infine, affrontare le questioni di come viene determinato il tasso di crescita e fattori che influenzano il tasso di crescita. Il protocollo risolve tutti i fattori che dovrebbero essere presi in considerazione per la quantificazione precisa e ripetibile di crescita batterica. Il metodo sperimentale e l’analisi sono descritti dettagliatamente nel testo principale. Questo metodo permette l’analisi precisa e riproducibile della crescita batterica in un modo ad alta velocità. Microbiologi possono utilizzare questo protocollo per derivare ulteriori risultati quantitativi da loro evidenza sperimentale. Questo protocollo è utilizzabile anche per gli studi in biologia dei sistemi che tentano di trarre conclusioni concettuale o per ottenere una panoramica teorica della crescita.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fasi critiche nel protocollo prevedono la preparazione di un fondo comune delle cellule e la replica di stessi campioni in pozzi multipli in diverse posizioni sulla micropiastra in crescita esponenziale. Microbiologi avviato in precedenza, la cultura da una pre-cultura durante la notte. Mentre questo metodo può ridurre il tempo di ritardo di crescita batterica, è difficile da realizzare curve di crescita riproducibile. Come mostrato nella Figura 2, le misure indipendenti utilizzando le sco…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
Riferimenti
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