Точный, высокой пропускной способности анализ роста бактерий
Summary
Количественная оценка бактериального роста имеет важное значение для понимания микробной физиологии как явление системного уровня. Внедряются протокол для экспериментальных манипуляций и аналитический подход, позволяя для точного, высок объём анализ роста бактерий, который является ключевым предметом интереса в биологии систем.
Abstract
Рост бактерий – это центральное понятие в развитии современной физиологии микроорганизмов, а также в расследовании сотовой динамика на уровне системы. Недавние исследования сообщили корреляции между роста бактерий и геном общесистемного события, такие как сокращение и транскриптом реорганизацию генома. Правильно анализировать бактериальный рост имеет решающее значение для понимания роста зависит от координации функций генов и клеточных компонентов. Соответственно требуется точной количественной оценки роста бактерий в духе высокой пропускной способности. Новые технологические разработки предлагают новые экспериментальные инструменты, которые позволяют обновления методов, используемых для изучения роста бактерий. Протокол, представил здесь использует Считыватель микропланшетов с оптимизированный экспериментальной процедуры для воспроизводимых и точные оценки роста бактерий. Этот протокол был использован для оценки роста нескольких описанных ранее штаммов Escherichia coli . Основные этапы протокола заключаются в следующем: подготовка большого числа клеток запасов в небольших флаконах для повторных тестов с воспроизводимые результаты, использование 96-луночных пластин для оценки роста высокой пропускной способностью и ручной расчет двух крупных Параметры (то есть, максимального роста скорость и плотность населения) представляющий динамику роста. По сравнению с традиционными колонии формирование подразделения (CFU) assay, который подсчитывает количество ячеек, которые культивировали в стеклянных трубок со временем на плитах агара, нынешний метод является более эффективным и дает более подробной временной записи изменения роста, но имеет более строгие предел обнаружения в низкой плотностью населения. В целом описан метод выгодно для точного и воспроизводимого высок объём анализа роста бактерий, которые могут использоваться для концептуальной выводы или сделать теоретические замечания.
Introduction
Микробиологические исследования часто начинаются с культурой бактериальных клеток и оценки кривых роста бактерий, которые представляют собой явление основных бактериальной физиологии1,2,3. Основные культуры принципы широко доступны в опубликованных исследований литературы и учебников, потому что Бактериальная культура является основным методологии. На уровне скамейке значительное внимание традиционно уделяется оптимизации роста СМИ и культивирования условий, но контролирования показателя роста, который скорее всего обеспечит еще большее понимание физиологии микроорганизмов, не был широко изучены4. Для экспоненциально растет бактерий, ключевым параметром клеточного государства является прирост, который было сообщено координироваться с геном, транскриптом и протеом5,6,7,8 . Таким образом количественные оценки бактериального роста имеет решающее значение для понимания физиологии микроорганизмов.
Для оценки роста бактерий, экспериментальные методы, используемые для оценки биомассы хорошо организованной9,10 и основаны на обнаружение биохимических, физические или биологические параметры, такие как оптическая мутность. Кроме того аналитические методы, используемые для захвата динамические свойства изменения роста обычно основаны на установленных нелинейной модели11,12,13, например, логистических уравнений. Динамика роста обычно приобретают приурочен выборки роста клеток в культуре путем измерения оптическая мутность или выполнении анализов колонии формирование подразделения (CFU). Ограничение этих методов культивирования и обнаружения является, что точки данных не являются подлинным отражением динамики народонаселения, поскольку измерение интервалов, часто в часах состояние культуры (например, изменения температуры и Аэрация) нарушается во время выборки. Культура и анализа методов должны быть обновлены с использованием последних изменений в технологии и понимания. Последние достижения в Гонав читателей позволяют в реальном времени наблюдения роста бактерий и значительно уменьшить затраты труда. С помощью этих передовых устройств, последние исследования на рост бактерий сообщили аналитические методы для высокой пропускной способностью измерений14,15.
Цель настоящего Протокола заключается в оценить точные динамика в духе высокой пропускной способности, которая будет ценным для количественных исследований, которые в конечном итоге решать вопросы как определяется темпы роста и какие факторы влияют на темпы роста. Протокол устраняет все факторы, которые следует учитывать для воспроизводимой и точный количественный рост бактерий. Экспериментальный метод и анализа описаны подробно в основном тексте. Этот метод позволяет точные и воспроизводимые анализ роста бактерий в духе высокой пропускной способности. Микробиологи можно использовать этот протокол получить дополнительные количественные результаты от их экспериментальных доказательств. Этот протокол также может использоваться для исследования в биологии систем, которые пытаются концептуальной выводы или достичь теоретический обзор роста.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важнейшие шаги в протоколе включают разработку обыкновенных акций экспоненциально растущей клетки и репликации же образцов в нескольких скважин в различных позициях на микроплиты. Ранее микробиологов начал культуры от ночи до культуры. Хотя этот метод может сократить время запаздыв?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы не имеют ничего сообщать.
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
Riferimenti
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
- Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
