Presis, høy gjennomstrømming analyse av bakterievekst
Summary
Kvantitativ vurdering av bakteriell vekst er viktig å forstå mikrobiell fysiologi som systemer nivå fenomen. En protokoll for eksperimentell manipulasjon og en analytisk tilnærming er innført, slik at presis, høy gjennomstrømming analyse av bakterievekst, som en nøkkel gjenstand for interesse systemer biologi.
Abstract
Bakteriell vekst er et sentralt begrep i utviklingen av moderne mikrobiell fysiologi og etterforskning av mobilnettet dynamics på systemnivå. Nyere studier har rapportert sammenhenger mellom bakterievekst og genomet-wide hendelsene genomet reduksjon og transcriptome omorganisering. Riktig analysere bakterievekst er avgjørende for å forstå vekst-avhengige samordning av genet funksjoner og cellulære komponenter. Følgelig kreves nøyaktig kvantitativ vurdering av bakterievekst i en høy gjennomstrømming måte. Nye teknologiske utviklingen tilbyr nye eksperimentelle verktøy som tillater oppdateringer av metodene som brukes for å studere bakterievekst. Protokollen innført her benytter en microplate leseren med en optimalisert eksperimentelle prosedyren for reproduserbare og nøyaktig vurdering av bakterievekst. Denne protokollen ble brukt til å evaluere veksten av flere tidligere beskrevet Escherichia coli stammer. De viktigste trinnene av protokollen er som følger: utarbeidelse av et stort antall celle aksjer i små ampuller for gjentatte tester med reproduserbar resultater, bruk av 96-brønns plater for høy gjennomstrømming vekst evaluering og manuell beregning av store parametere (dvs., maksimal vekst rate og befolkningen tetthet) representerer vekst dynamikken. I forhold til tradisjonelle colony-forming unit (CFU) analysen, som teller cellene som er kultivert i glass rør over tid på agar plater, nåværende metoden er mer effektiv og gir mer detaljert timelige poster vekst endringer, men har en strengere gjenkjenning grense på lav befolkningstetthet. Oppsummert er metoden beskrevet fordelaktig for presis og reproduserbar høy gjennomstrømming analyse av bakterievekst, hvilke kan brukes å konseptuell konklusjoner eller gjøre teoretisk observasjoner.
Introduction
Mikrobiologisk studier starter ofte med kulturen i bakterielle celler og vurdering av bakterievekst kurvene, som representerer et grunnleggende fenomen bakteriell fysiologi1,2,3. Grunnleggende kultur prinsippene er allment tilgjengelig i publisert forskningslitteratur og lærebøker fordi bakteriell kultur er en grunnleggende metode. På benken nivå, betydelig oppmerksomhet har tradisjonelt vært fokusert på optimalisering vekst medier og dyrking forhold, men kontrollere veksten, som trolig ville gi enda større forståelse av mikrobielle fysiologi, har ikke vært grundig studert4. Eksponensielt voksende bakterier, er en viktig parameter av mobilnettet vekstraten, som har blitt rapportert som skal koordineres med genom, transcriptome og proteom5,6,7,8 . Dermed er kvantitativ vurdering av bakteriell vekst avgjørende for å forstå mikrobiell fysiologi.
For å evaluere bakterievekst, eksperimentelle metoder brukes til å beregne biomasse er godt etablert9,10 og er basert på oppdagelsen av biokjemiske, fysiske eller biologiske parametere, for eksempel optisk turbiditet. I tillegg er de analytiske metodene brukes til å fange de dynamiske egenskapene til vekst endringer vanligvis basert på etablerte ikke-lineære modeller11,12,13, for eksempel logistikk ligninger. Vekst dynamics er vanligvis kjøpt av tidsbestemte utvalg av cellevekst i kultur måle optisk turbiditet eller utføre colony-forming unit (CFU) analyser. Begrensning av metodene dyrking og oppdagelsen er at datapunktene ikke er en sann refleksjon av populasjonsdynamikk fordi måling intervallene er ofte i timer og fordi betingelsen kultur (f.eksendringer i temperatur og lufting) er forstyrret ved prøvetaking. Kultur og analyse må oppdateres med den siste utviklingen i teknologi og forståelse. Nylige fremskritt innen microplate lesere at sanntid observasjon av bakterievekst og betydelig redusere arbeidskostnader. Med disse avanserte enheter, rapportert de nyeste studiene på bakterievekst analytiske metoder for høy gjennomstrømming målinger14,15.
Formålet med denne protokollen er å evaluere presis vekst dynamikken i en høy gjennomstrømming måte, som vil være verdifulle for kvantitative studier som til slutt ta opp spørsmål hvor veksten bestemmes og hvilke faktorer som påvirker vekstraten. Protokollen løser alle faktorer som bør tas i betraktning for repeterbare og presis kvantifisering av bakterievekst. Eksperimentell metode og analyse er beskrevet i detalj i hovedteksten. Denne metoden tillater presis og reproduserbar analyse av bakterievekst i en høy gjennomstrømming måte. Microbiologists kan bruke denne protokollen utlede flere kvantitative resultater fra deres eksperimentelle bevis. Denne protokollen kan også brukes for studier i systems biology som forsøker å konseptuell konklusjoner eller å oppnå en teoretisk oversikt over vekst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avgjørende skritt i protokollen inkludere utarbeidelsen av en felles lager eksponensielt voksende celler og replikering av samme eksemplene i flere brønner på ulike posisjoner på microplate. Tidligere startet microbiologists kulturen fra en overnatting før kultur. Mens denne metoden kan redusere oppholdstiden av bakteriell vekst, er det vanskelig å oppnå reproduserbar vekst kurver. Som vist i figur 2, førte uavhengige målinger ved hjelp av vanlige glyserol aksjer nesten identisk vek…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ikke avsløre.
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
Riferimenti
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
- Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
