Summary
많은 비전을 위협 눈 질병 장애 망막 microvessels와 연결 됩니다. 따라서, 망막 되 응답의 측정은 기본 병 태 생리 기계 장치를 조사 하는 것이 중요. 이 문서에서는 마우스 망막 되 격리와 혈관 직경에 vasoactive 물질의 효과 평가 하기 위해 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
혈관 불충분 그리고 정상 망막 관류 변경 다양 한 시력을 위협 하 고 안구 질환, 당뇨병 성 망막 증, 고혈압 성 망막 증 및 녹 내장 등의 병 인에 대 한 주요 요인 중입니다. 따라서 망막 microvascular 준비 중추적인 도구 기본 병 태 생리 기계 장치 윤곽을 그리 다 생리 및 약리 연구 및 질병에 대 한 치료를 디자인 하는. 안과 연구에 마우스 모델의 광범위 한 사용에도 불구 하 고 망막 혈관 반응성에 대 한 연구는이 종에서 부족. 이 불일치에 대 한 주요 이유는 도전적인 격리 절차는 이러한 망막 혈관의 작은 크기 때문 ~ luminal 직경에서 ≤ 30 µ m. 기능 연구에 대 한 이러한 망막 microvessels의 직접 분리의 문제를 회피, 우리 ex vivo 마우스 망막 vasoactivity 근처 생리 적 조건 하에서 연구를 가능 하 게 절연 및 준비 기술 설립 . 현재 실험 준비 특히 마우스 망막 arterioles를 참조 것입니다, 하지만이 방법은 쉽게 사용할 수 있습니다 microvessels에 쥐에서.
Introduction
망막 관류에 장애 당뇨병 성 망막 증, 고혈압 성 망막 증, 녹 내장1,2,3등 다양 한 안구 질환의 병 인에 연루 되었습니다. 따라서, 망막 혈관 반응성을 측정 하기 위한 연구는 이러한 질병의 병 태 생리학을 이해 하는 것이 중요 하 고 접근 새로운 치료를 개발 하.
Murine 게놈에서 유전자 조작의 가능성으로 인해 마우스4심장 혈관 시스템 연구에 대 한 널리 사용 되는 동물 모델 되고있다. 그러나, 망막 혈관 (≤ 30 µ m)의 작은 크기 때문에 측정 마우스 망막 혈관 반응성의 도전 이다. 예를 들어 stereomicroscopic vivo에서 측정을 위한 그들의 광학 해상도 제한 기술과 따라서 ≤ 30 µ m 직경 장비 될 때 보다는 더 적은의 작은 피에 지름 또는 혈액 흐름에 변화를 정확 하 게 탐지를 허용합니다 confocal 현미경 또는 적응 광학 스캔 빛 Ophthalmoscope5,6형광 염료를 사용 하 여 같은 추가 정교한 장치 합니다. 또한, 해석 vivo 측정 지역 식별 목적으로 조직 혈압과 retrobulbar 혈관의 영향 변화 신호 망막 혈관에서 메커니즘 마 취약에 의해 혼동 될 수 있습니다.
따라서, 우리는 ex vivo높은 광학 해상도와 마우스 망막 혈관의 반응을 측정 하는 방법을 개발 했다. 여기에 소개 하는 기술 망막 arterioles 통해 전송 가벼운 현미경 검사 법의 시각화 수 있습니다. 이 메서드를 사용할 수 있는 또한 쥐에, 안구 혈관 연구에서 기술을 대상으로 하는 유전자의 장점에 대 한 액세스를 제공 합니다.
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Protocol
이 연구의 실험 절차에 의해는 동물 관리 위원회의 라인란트-Palatinate, 독일 승인 되었다. 동물 보호 안과에서 동물의 사용에 대 한 비전과 안과 (ARVO) 성명에서 연구 및 비전 연구 기관 지침 및 협회에 맞 췄 나. 동물 동물 실험에 대 한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 치료 했다. 남성 C57BL/6J 쥐 (The 잭슨 실험실, 바 하버, 나, 미국) 3-4 개월을 세는 실험을 위해 사용 되었다. 동물 표준 조건 (온도 23 ± 2 ° C, 습도 범위 55 ± 10% 및 12 h 명암 주기), 유 숙 했다 그리고 표준 마우스 차 우와 물 광고 libitum에 접근 했다.
1입니다. 마우스 망막의 분리
- 해 부 악기를 준비 테이블에 놓고 모든 악기 가능 빠른 준비 완료 확인 합니다.
- CO2 흡입에 의해 마우스를 희생.
- 스틸가 위 마우스를 목을 벨, 두개골 sagitally가 위의 동일한 쌍을 사용 하 여 두 개의 반쪽으로 잘라 고 피부와 뇌 눈이 위 (그림 1)를 사용 하 여 제거 합니다.
- 눈이 위를 사용 하 여 궤도 뼈를 떠나 두개골 뼈를 잘라.
- 얼음 처럼 차가운 Krebs Henseleit 버퍼를 포함 하는 해 부 접시에 궤도 전송 합니다.
- 얼음에 해 부 접시를 유지 하거나 변경할 버퍼 마다 10 분.
- 눈이 위를 사용 하 여 궤도 뼈를 잘라내어 눈 지구 궤도 조직 유형 4 정밀 핀셋과 학생 욕실이 봄이 위 (그림 2)를 사용 하 여 함께 제거.
- 부드럽게 Harderian 선, 결합 조직, 그리고 안구 근육 유형 5 정밀 핀셋과 안과 동맥의 주요 분기를 손상 하지 않도록 주의 복용 욕실이 capsulotomy가 위를 사용 하 여 제거 합니다.
- 궤도 안과 동맥의 지점과 결국 10-0 나일론 봉합 (그림 3)를 사용 하 여 안과 동맥의 주요 지점의 인접 끝 선.
- 10 s 사용 하 여 입력 4 정밀 핀셋에 대 한 70% 에탄올을 포함 하는 배양 접시에 눈 세계를 전송 합니다. 해 부 접시에 다시 눈 지구를 놓고 신선한 Krebs 솔루션으로 버퍼를 대체 합니다. 각 막 에탄올 노출 후 약간 흰 나타납니다.
- 주변 막 30 게이지 바늘으로 찔린 고 욕실이 capsulotomy가 위를 사용 하 여 각 막 해 부. 부드럽게 잘라 아이리스 조직, 맥락 막과 망막 사이 욕실이 capsulotomy가 위 한 날카로운 시점 놓고 맥락 막 및 공 막 잘라. (그림 4) 시 신경 주위 scleral 조직 일부를 남겨 주세요.
2. 망막 관류 챔버에 장착
참고: 망막 되 실험을 위해 사용 하는 관류 챔버는 집에서 만든. -및 유출 관 (그림 5)와 함께 투명 한 저수지 그것에 의하여 이루어져 있다. 실리콘 튜브의 한쪽 끝은 histoacryl 접착제와 3 방향 자 지에 연결 된 반대쪽 챔버의 바닥에 붙어 됩니다. 3 방향 자 지에 신선한 Krebs 버퍼를 포함 하는 주사기를 연결 하 고 버퍼와 튜브를 작성.
- 바늘 홀더를 가진 유리 제 micropipette 고 관류 챔버의 하단 튜브의 끝에 그것을 밀어. 다음 100 µ m 직경의 팁을 얻기 위해가 위 종류 4는 micropipette의 팁을 휴식.
- micropipette 끝에 집중 하 고 통해 주사기 튜브에 연결 그것을 플러시. 모 세관 파편에 의해 가려진 하지 주의. 폐색, 경우 그것을 제거 하 고 튜브를 플러시 다른 micropipette 삽입.
- 차가운 Krebs 버퍼 관류 챔버와 스테레오 현미경 챔버를 넣어.
- 관류 챔버에 투명 한 플라스틱 플랫폼을 놓습니다. 이 플랫폼은 시 신경 및 눈 동맥에 대 한 1.8 m m 폭의 들여쓰기 하 고 1.6 m m 직경의 2 개의 강철 와이어에 배치 됩니다. 다음, 2.8 m m 내경 및 플랫폼에 4.0 m m 외부 직경의 스테인레스 스틸 반지 장소.
- 숟가락을 사용 하 여 주의 해 부 챔버 관류 챔버로 망막 시 신경 및 연결 된 안과 동맥 전송. 이 단계는 가능성을 방지 하기 위해 중요 한 조직의 스트레칭으로 실험에 해로운 수 있습니다.
- 안과 동맥의 근 위 끝의 sutured 부분을, 장소는 micropipette에 10-0 나일론 봉합의 두 미리 형성한 루프 잘라내어는 micropipette와 안과 동맥을 cannulate. Micropipette (그림 6)에 동맥 고 괜 찮 아 요-포인트-핀셋을 사용 하 여 투명 한 플랫폼에 망막을 놓습니다.
- 부드럽게 두 괜 찮 포인트 핀셋으로 앞쪽 렌즈 capsula을 열고 눈물, 렌즈를 꺼내와 microscissors를 사용 하 여 전체 렌즈 capsula를 잘라.
- 그 후, 망막 시 신경에 동위 플에서 절반 거리에 4 개의 방사형 절 개를 확인 하 고 바닥에 그것을 해결 하기 위해 망막에는 스테인레스 스틸 반지를 배치. 망막은 이제 실험 (그림 7)에 대 한 준비.
3. 실험에 대 한 망막 Arterioles의 준비
- 가벼운 현미경 관류 챔버를 놓습니다. 목표는 100 X 물 침수 렌즈입니다.
- Pericyclic 펌프는 두 개의 튜브에 대 한에-및 아웃-flow를 연결 하 고 95% O2 산소 하 고 37 ° c.에 5% CO2 탄산 Krebs 버퍼와 챔버를 순환 100 사이 120 mL/min 유량을 사용 합니다.
- 저수지 실리콘 호스를 통해 3 방향 자 지에는 micropipette에 연결 된 실리콘 튜브를 연결 합니다. 그런 다음 Krebs 버퍼 높이 50 mm Hg에 해당 하는 저수지를 채울 하지만 3 방향 자 지 아직 열지 마십시오.
- 현미경과 망막 표면에 초점의 목표 통해 보세요. 혈관 또는 붉은 혈액 세포에 대 한 검색. 혈관은 완전히 붕괴, 그래서 때로는 일부 붉은 혈액 세포를 볼 수 있습니다만 가능 하다.
- 혈관 발견 되 면 그것에 집중 하 고 3 방향 자 지를 엽니다. 혈관의 직경은 즉시 증가 해야 하 고 붉은 혈액 세포 이동 중 배, 한 되는 경우 또는 centripetally는 venule 경우. arterioles 직경 venules의 순서에 비해 작은 수 있습니다.
- 잘 보이는 벽 혈관 발견 되 면 그것은 30 분 (그림 8)의 재래식 기간 뒤 실험에 대 한 사용할 수 있습니다. 재래식 기간 동안는 arterioles 결과 luminal 직경 감소 10% 미만에 약한 내장 음색을 개발 합니다.
4. 실험 수행
- 목욕 솔루션에 추가 하 여는 thromboxane 모방 9,11-미치기-9α, 11α methanoepoxy 스타 글란 딘 F2α (U46619)와 혈관의 생존 능력을 테스트 합니다. 이 에이전트는 ≥ 10의 농도에서 휴식 하는 직경에서 약 50% 마우스 망막 arterioles 수축-6 M.
- 일단 그릇은 가능한 확인, 순환 펌프에 의해 목욕에서 길 항 제를 세척 하 고 목욕으로 신선한 Krebs 버퍼를 공급.
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Representative Results
U-46619 농도-종속 vasoconstrictor 응답 망막 arterioles 야생-타입 마우스 C57Bl/6J 배경에서 생산. 10-6 M의 농도에서 luminal 직경에서 감소는 휴식 직경에서 ≈50 %를 했다. 그림 9A 한 망막 되의 대표적인 농도-응답 곡선을 보여 줍니다. U46619와 preconstricted arterioles에 아 세 틸 콜린의 누적 관리 갖는 luminal 직경 농도 의존 증가 ≈25 %를 10-5 M, 그대로 혈관 내 피 (지표에 preconstricted 직경에서 그림 9B)입니다.
그림 1: 마우스 두개골의 해 부. 잘린된 마우스 머리에 피부 노출 눈과 궤도 구멍 제거 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 눈 글로브와 궤도 조직의 격리. 궤도 뼈는 눈이 눈 세계 retrobulbar 조직 함께 고 시 신경 신중 하 게 고립 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 눈 글로브와 안과 동맥의 준비. 일단 주변 궤도 조직 했다 괜 찮 아 요 microscissors로 해 부, 안과 동맥은 신중 하 게 노출 되 고 그들의 작은 가지는 10-0 나일론 monofilament 봉합 출혈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 눈의 해 부. 망막을 시각화 하 고 sclera uvea 욕실이 capsulotomy가 위 해 부 했다. 시 신경 주위 조직 일부 scleral 안과 동맥의 손상을 방지 하기 위해 남아 있지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 실시간 비디오 현미경 검사 법에 대 한 기관 실. 홈 챔버가 했다. 배양 접시는에서 및 밖으로 flow 튜브 100 m m 직경의 그것에 의하여 이루어져 있다. 튜브는 histoacryl 접착제로 붙어 있었다. 외부에서 산소와 탄산 Krebs Henseleit 버퍼는이 관을 통해 연동 펌프에 의해 유통 되었다. 실리콘 튜브의 한쪽 끝을 챔버와 3 방향 자 지에 연결 된 다른 쪽 끝의 아래쪽에 붙어 했다. 튜브의 끝에, 100 µ m의 끝을 가진 유리 제 micropipette cannulation 안과 동맥의에 대 한 봉사 삽입 되었다. 실리콘 튜브를 통해 안과 순환 50 mm Hg. 해당 수준에 Krebs 버퍼와 실리콘 튜브를 작성 하 여 가압은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 안과 동맥의 Cannulation. 안과 동맥 유리 제 micropipette와 cannulated 하 고 10-0 나일론 봉합으로 봉합 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 안과 동맥의 Cannulation. 투명 플랫폼에 망막을 삽입 후 capsular 가방 렌즈 제거 되었다, 4 개의 방사형 절 개, 망막에 고 링 2.8 m m 내경 및 외경 4.0 m m의 스테인리스 b에 그것을 해결 하기 위해 망막에 배치 했다 ottom입니다. 망막은 다음 실험을 위해 준비 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 망막 혈관의 시각화. 적혈구 내부와 모범적인 망막 되.
그림 9: 비디오 현미경을 사용 하 여 기능 연구. 단일 망막 되에서 대표 농도 응답 곡선. (Vasoconstrictor, U46619에 대 한 A) 농도 응답 곡선 (10-9 10-6 M를), 그리고 (B)에 대 한 endothelium 종속 vasodilator, 아 세 틸 콜린 (10 10-5 M를-8 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
마우스 망막에 혈관 반응의 측정은 망막 혈관의 작은 크기 때문에 도전 이다. 제시 기법으로 망막 arterioles 전송된 가벼운 현미경 검사 법에 의해 시각화 됩니다. 이 격리 된 망막은 반투명 하기 때문에 가능 하다. 기술의 장점은 높은 광학 해상도입니다. 계산된 공간 해상도 11 픽셀 / µ m 이다. 그러나, 하얀 빛을 사용 하 여이 광 시스템에 대 한 실제 해상도 Abbe 회절 한계에 의해 설명 된다 200, 300 nm 사이입니다. 마우스 망막 arterioles의 첫 번째 분기에는 20 ~ 30 μ m의 내부 직경, 이후 약 1%의 직경 변화가이 시스템으로 알 수 있습니다. 작은 망막 arterioles5,,67시각화에 추가 기술 장치 또는 다른 연구에서 보고 형광 염료의 필요가 있다. 기술의 단점은 훈련 된 수 사관 90 ~ 120 분 사이 긴 준비 시간입니다. 준비 시간 180 분을 초과 하면 내 피 기능 감쇠 될 시작 합니다.
이 기술에는 여러 주요 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 철저 하 게 모든 retrobulbar 동맥 분기를 위하여 중요 하다. 결 찰 완료 하지 않으면 망막 arterioles 누설 때문 가압 하지 것입니다. 둘째, 10에 대 한 에탄올에 침수 눈 세계를 열기 전에 s은 안과 동맥의 평활 근 반응성을 비활성화 하는 것이 중요. 우리가 이전 10에 대 한 그 immersing 시연 s 70% 에탄올에 완전히 비활성화 안과 동맥 평활 근8. 대조적으로, 망막 arterioles 직접 의해 영향을 받을 에탄올, 안구 벽에 의해 보호 되기 때문에 가능성이 있습니다. 이 단계를 생략 하면 안과 동맥에서 직경 변화 망막의 관류의 영향을 미칠 수 있습니다. 메모의, 안과 동맥의 반응성 망막 arterioles 동일한 주 작동 근9,10에 대 한 응답의 현저 하 게 달라질 수 있습니다. 셋째, 안과 동맥의 비틀림을 하지 마십시오. 특히 망막 준비 플랫폼에 탑재 하는 동안 안과 동맥 수 있습니다 될 트위스트, 폐색 루멘의 결과로. 또한, 신중 하 게 유리 모 세관의 끝의 망막 arterioles 가압 수 있도록 차단 되지 확인 합니다. 아 세 틸 콜린에 대 한 응답 되었다 약한 농도 응답 곡선 이상 세 번 반복 하면 관찰 하기 때문에 동일한 망막 준비에 3 개 이상의 연속 농도-응답 곡선을 수행을 하지 하시기 바랍니다. 그러나, 있을 수 있습니다 에이전트에 따라 농도 응답 곡선의 반복성에 관한 차이 적용 하 고, 따라서, 개별적으로 테스트 해야 합니다.
우리는 적용 하는 약리 에이전트 extraluminally intraluminal 관류 서보 제어 펌프를 사용 하는 것도 가능 하지만 우리의 연구에. 기술은 생쥐와 쥐를 포함 하 여 작은 실험실 동물의 망막 혈관 반응성의 지역 메커니즘에 대 한 측정을 허용, 이후 유전자 변형된 동물을 사용 하 여 유전자를 대상으로 한 기술의 이점은이 방법으로 액세스할 수 있습니다. .
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.
Acknowledgments
이 작품은 도이치 Ophthalmologische 분야 (개)와 에른스트 und Berta Grimmke 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
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