架橋反応性無料、スポッター無料多重サンドイッチ免疫測定用チップをスナップします。
Summary
単に 2 つのスライドをスナップすることによって十字反応性無料多重サンドイッチ免疫測定を実行するためのスナップ チップ技術を紹介します。スナップの装置は、マイクロ アレイ-マイクロ アレイから試薬を確実に転送するために使用されます。スナップ チップは、クロス汚染せず異なる試薬の共存に注目を必要とする任意の生化学的な反作用に使用できます。
Abstract
多重蛋白質の分析は優れた診断感度と単一蛋白質と比較して精度を示しています。抗体のマイクロ アレイ マイクロ スケール イムノアッセイ単一チップ上で同時に実行の数千人を可能にします。サンドイッチ試金形式 2 抗体各ターゲットを検出することによりアッセイの特異性を向上させるが、したがって、多重化機能、制限試薬の交差反応性に苦しんでいます。抗体マイクロ アレイの共存 (ACM) 多重化タンパク質の架橋反応性無料検出用に開発されたアッセイ中マイクロ アレイ作製のため、高価なスポッター敷地内が必要です。この作品で一緒に、こうして偵察する必要はありませんサンプルの培養と検出抗体 (指紋) に後続のアプリケーションの間に単にスナップ 2 つのチップによってマイクロ アレイ-マイクロ アレイから試薬を転送スナップ チップ技術を紹介します。試金の実行からのスライドの準備を解離斑点を付けられた前のスライドのストレージ。2 つのマイクロ アレイ間の正確な配置を達成するために両方のシングルとダブルの転送方法と両方の方法のスライド作製を説明しました。結果を示す < 40 μ m の位置合わせは、二重譲渡、625 スポット/cm2の配列密度に到達を達成されています。多重化されたタンパク質解析のスナップ チップの使いやすさを実証する 50 plexed 免疫測定法を実施しています。35 蛋白質の検出限界は、範囲の pg/mL にあります。
Introduction
高い感度と特異度癌1,2のような複雑な疾患の診断における単一マーカーよりも複数のタンパク質を含むバイオ マーカーのパネルがあります。酵素結合抗体法 (ELISA) はゴールド スタンダード技術を臨床研究所プラズマにおける低 pg/ml 検出限界がアッセイ3,4,5あたり 1 つのターゲットに制限を達成するために使用されています。抗体のマイクロ アレイは、単一顕微鏡スライド6,7、8に並行して実施小型の試金の何千もの収容のために開発されています。ただし、このメソッドの多重化機能は、指紋の混合物のアプリケーションから生じる試薬駆動の交差反応によって制限されます、それはターゲット9,10数の増加により問題となります。,11. Plaら。多重サンドイッチ試金の結果として脆弱性スケール N は目標12の番号 4N(N-1) として表明しています。
抗体のマイクロ アレイ、抗体の共存のマイクロ アレイでの交差反応性を軽減するために (ACM) 多重サンドイッチ試金12の私たちの研究室で開発しました。キャプチャー抗体 (タクシー) はマイクロ アレイのスポッターと基板上斑点を付けられます。ブロック サンプルが表面に適用され、cAb 抗原複合体と同じスポットに個々 の指紋を発見し。抗体と抗原との間のすべての交差反応性シナリオことができます ACM、軽減して pg/ml 検出限界が達成されています。ただし、試金のプロトコルは高価で時間のかかる配置目的のため精度の高い敷地内マイクロ アレイ スポッターを使用して、この技術の広い適用を制限する実験中に、指紋をスポッティングの準備と必要になりますその他の研究所。スナップ チップの名前、ハンドヘルド ACM は架橋反応性自由のために開発されている、サンドイッチ免疫測定13,14,15を多重化スポッター無料します。タクシーや指紋は事前の試金スライドとマイクロ アレイ フォーマットのそれぞれ転送スライドに斑点を付けるし、格納されています。アッセイ中にスライドを取得、指紋のマイクロ アレイは単に 2 つのチップを一緒に撮ってアッセイのスライドにまとめてに転送されます。スナップの装置は、信頼性の高い試薬転送に使用されます。比較的大きな抗体結合能を持つニトロセルロース コーティング スライドは、液体の液滴を吸収するアッセイ スライドとして使用されている、ため、試薬譲渡が容易、しかし、スライドがより規則的なガラスのスライドとマイクロ アレイよりも高価です非透明スライドと互換性のあるスキャナー信号集録が必要です。
この作品は、スナップ チップを搭載した多重サンドイッチ免疫測定法を実行するプロトコルを示す.新しいスナップイン装置マイクロ アレイ-マイクロ アレイからより便利で信頼性の高い試薬譲渡しました。重要なは、ここでスナップ チップと通常のガラス スライド上に試薬転送法を確立しました。1024 点は正常に移され、ほとんどの実験室でこの技術の使用を大幅に広げてスライド ガラス上に配置されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この作品は、私たちは基本的な実験のセットアップを持つ研究者の多重相互反応性無料イムノアッセイは広く利用可能、スナップ チップ技術を発表しました。既存の抗体のマイクロ アレイとは異なり、マイクロ アレイ スポッターは不要エンドユーザーです。、両方のシングルとダブルの転送方法をデモンストレーションし、二重譲渡提供に優れたアライメント精度 〜 98% スポット、63 μ m<s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
インク ジェット偵察の使用ありがとう博士ロブ スラデック。我々 は最終的なカナダの機関からのサポート健康研究 (機構)、自然科学と工学研究審議会のカナダ (レベル)、カナダの癌協会の研究・ カナダ基礎技術革新 (CFI) を認めます。D. j. のおかげでは、カナダの研究の椅子からサポートします。
Materials
| Phosphate buffered saline tablet | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Streptavidin-conjugated Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer | SurModics, Inc | SG02 | |
| Nitrocellulose coated slides | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Aminosilane coated slides | Schott North America | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Inkjet microarray spotter | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Slide module gasket | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Humidity Stabilization Beads | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer software | Media Cybernetics | Version 4.5 | |
| Fluorescence microarray scanner | Agilent | SureScan Microarray Scanner | |
| Biostatistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| Endoglin capture antibody | R&D Systems | MAB10972 | |
| Endoglin protein | R&D Systems | 1097-EN | |
| Endoglin detection antibody | R&D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (see Table 1) | R&D Systems | ||
| IL-6b (see Table 1) | Invitrogen |
Riferimenti
- Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
- Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
- Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
- Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
- Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
- Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
- Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
- Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
- Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
- Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
- Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
- Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
- Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
- Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
- Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
- Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
- Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
- Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
- Lee, M. -. Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
- Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
- Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
- Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).
