ミトコンドリアの Ca2 +保持容量測定と Ca2 +-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガー

Summary

このプロトコルが Ca^{2 +}保持能力と Ca^{2 +}を調べる方法を説明することを目的 – トリガー SH SY5Y 分離ミトコンドリアの膨潤ミトコンドリア細胞ステップバイ ステップ。

Abstract

酸化的リン酸化による ATP の生産は、ミトコンドリアの主要な機能です。高等真核生物のミトコンドリアは細胞内 Ca^{2 +}のバッファリングにも参加し、ミトコンドリアで、ATP を生産することができます無料のミトコンドリア内 Ca^{2 +}濃度によって媒介されます。Ca^{2 +}保持能力は、ミトコンドリアのマトリックスでカルシウムを保持するミトコンドリアの機能としてみなすことができます。蓄積された細胞内 Ca^{2 +}の内ミトコンドリア膜透過性につながるでは、ミトコンドリア膜透過性遷移孔 (mPTP)、分子と分子の漏れにつながる重量未満 1.5 kDa の開口部と呼ばれます。Ca^{2 +}-腫れ、mPTP 開口部を示すためミトコンドリアをトリガーします。ここで、Ca^{2 +}保持能力と Ca^{2 +}を検討する 2 つの試金を記述-分離ミトコンドリア ミトコンドリアの膨潤をトリガーします。一定量に Ca^{2 +}が追加されますすべての手順を実行することができます 1 日で完了なりマイクロ プレート リーダーによって記録されました。したがって、これら 2 つのシンプルで効果的なアッセイを採用して、Ca^{2 +}を評価できる-関連するミトコンドリアの機能。

Introduction

ミトコンドリアは、酸化的リン酸化による哺乳類細胞で使用される ATP の約 95% を生産する主要な細胞器官です。合成 ATP¹に ADP をリン酸化して使用できます、ADP と無機リン酸の存在、人里離れたマイクロモル濃度 Ca^{2 +}ミトコンドリアによって報告されます。細胞内 Ca^{2 +}濃度がしきい値を超えると、ミトコンドリアが取り込み Ca^{2 +}急速および流出それゆっくり。したがって、機能しているミトコンドリアは、増加した細胞内 Ca^{2 +}の流入をことができます。無関係酸化的リン酸化に関与する、ミトコンドリア Ca^{2 +}もゾル性細胞質カルシウム信号の部分を取るし、mPTP のミトコンドリアの内側の開口部を誘導することによってミトコンドリアを介したアポトーシスのメカニズムをアクティブにします。膜²。細胞内 Ca^{2 +}の異常上昇が mPTP³を開くことによってミトコンドリアの大規模な腫れを引き起こすことができる広く認識されています。したがって、このプロトコルがミトコンドリアの Ca^{2 +}保持能力と Ca^{2 +}を定量化することでミトコンドリアの機能を評価することを目的-ミトコンドリアの膨潤が起きるというものです。

Ca^{2 +}保持能力ゾル性細胞質カルシウムを摂取するミトコンドリアの機能の測定であります。ミトコンドリアは細胞内遊離カルシウムをバッファーし、使用頻度の低い沈殿物の形でカルシウム摂取によってカルシウム依存性細胞プロセスを調整できます。障害者 Ca^{2 +}保持能力にエネルギー制限とも神経変性疾患^4,5に関連するストレス現象に発生します。ミトコンまたはジギトニン グリセリン細胞 Ca^{2 +}保持能力を識別するために使用できます、追加グルタミン酸とリンゴ酸分離ミトコンドリアによる Ca^{2 +}を蓄積する高い能力は受けない、ミトコンドリアの分離手順⁶。ジギトニンの滴定された量を使用して、異なる種類の細胞の細胞膜を permeabilize ください。Hexapotassium 塩 Ca^{2 +}-緑色蛍光染料、Ca^{2 +}の結合-敏感な細胞非透過性可視光興奮インジケーターは、広く使用されている⁷をされています。Ca^{2 +}-(5 分) 刺激⁸延長バインド緑蛍光染料は低親和性インジケーターで、無料の細胞内 Ca^{2 +}濃度が上昇し続けることを示すために使用します。このメソッドは、放射性フィルター技術よりも敏感だったが、大幅に簡略化します。追加 Ca^{2 +}カルシウム緑色蛍光を高め、ミトコンドリアの Ca^{2 +}吸収がベースラインに蛍光を返します。逐次追加の Ca^{2 +}は、ミトコンドリア吸収 extramitochondrial Ca^{2 + 9}に失敗するまで行われました。蛍光マイクロ プレート リーダーは、継続的にカルシウム緑色蛍光を報告する使用できます。

Ca^{2 +}蓄積の後、ミトコンドリアが脱分極し、中に Ca^{2 +}放出ははれだした。Ca^{2 +}-腫れ、mPTP 開口部を示すためミトコンドリアをトリガーします。電子顕微鏡、Ca^{2 +}の測定に使用に 540 nm の吸光度の減少-ミトコンドリアの膨潤^10,11をトリガーします。前方角度光散乱で¹²、吸光度の減少がミトコンドリアのマトリックスの受動的な腫れを反映ミトコンドリア ボリュームを直接的に確認することができます。

ここで、我々 はミトコンドリアの Ca^{2 +}保持能力と Ca^{2 +}を検討する方法論を説明-SH SY5Y 細胞から分離ミトコンドリア ミトコンドリアの膨潤をトリガーします。

Protocol

1. ミトコンドリアの分離 注: すべてのソリューションや機器 0 – 4 ° C に冷却、氷で保たれます。 10 cm 細胞培養ディッシュあたり種子約 3 x 10 の6 SH SY5Y 細胞。高グルコース ダルベッコの培養細胞の 10% 牛胎児血清ペニシリン (100 U/mL) とイーグル培地、変更された-ストレプトマイシン (100 μ g/mL)。一晩 5% CO2を含むインキュベーターで 37 ° C で維持し?…

Representative Results

Ca2 +保持能力の代表の結果:結果は、蛍光値として表現されました。Ca2 + (200 nmols/mg ミトコンドリア蛋白質)、mPTP 開口基準上増蛍光付加パルス。5 μ M Bongkrekate (BKA)、Ca2 +の阻害剤-mPTP が開いたり、1 μ M atractyloside (ATR)、Ca2 +の活性化を誘導-mPTP オープニングを誘発、ミトコン ドリアにしました。合計追加 Ca2 +ベースライ?…

Discussion

ここでは、我々 はミトコンドリアの Ca^{2 +}の保持の能力分析と Ca^{2 +}のシンプルで効果的なプロトコルを記述した-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガーされます。

ミトコンドリアの分離セルを均質化する場合は特にすべての材料およびチューブは氷の上が存在することを確認します。0.25% トリプシン-EDTA は、37 ° C で 5 分間料理から細胞を切り離す場合…

Materials

SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001