Summary
Questo articolo descrive un protocollo per l'individuazione di uno o più del plasma e/o proteine di membrana intracellulare mediante microscopia ad alta super-risoluzione stato fondamentale lo svuotamento (GSD) in cellule di mammifero. Andremo a discutere i vantaggi e le considerazioni di utilizzare tali approcci per la visualizzazione e la quantificazione delle proteine cellulari.
Abstract
Gli avanzamenti nella biologia delle cellule e microscopia fluorescente sono intimamente correlati, con l'avanzata capacità di visualizzare eventi cellulari causando spesso drammatici salti nella nostra comprensione di come le cellule funzione. Lo sviluppo e la disponibilità della microscopia di Super-risoluzione ha notevolmente ampliato i limiti di risoluzione ottica da ~ 250-20 nm. I biologi non sono più limitati a descrivere le interazioni molecolari in termini di colocalizzazione all'interno di una zona di diffrazione limitata, piuttosto è ora possibile visualizzare le interazioni dinamiche delle singole molecole. Qui, descriviamo un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione delle proteine cellulari da microscopia di svuotamento di stato fondamentale per l'imaging cellulare fisso. Forniamo esempi da due proteine di membrana diversi, un elemento del Traslocone il reticolo endoplasmatico, sec61β e un membrana plasmatica localizzato tensione-gated L-tipo Ca2 + canale (CaV1.2). Vengono descritti il microscopio specifici parametri, metodi di fissazione, foto-commutazione formulazione di buffer e insidie e sfide di elaborazione delle immagini.
Introduction
Le reazioni cellulari di segnalazione traducono cambiando ambienti interni ed esterni per avviare una risposta cellulare. Esse regolano tutti gli aspetti della fisiologia umana, che serve da base per l'ormone e rilascio di neurotrasmettitori, il battito cardiaco, visione, fertilizzazione e funzione conoscitiva. Rottura di queste cascate di segnalazione può avere gravi conseguenze sotto forma di condizioni patologiche tra cui cancro, morbo di Parkinson e di Alzheimer. Per decenni, gli investigatori biologici e medici sono utilizzati con successo le proteine fluorescenti, sonde e biosensori accoppiati con microscopia di fluorescenza come i principali strumenti per comprendere l'organizzazione spaziale e temporale preciso di questi cellulari segnali.
I punti di forza di tecniche ottiche quali epifluorescenza, confocale, o microscopia a fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale sono loro sensibilità, velocità e compatibilità con live cell imaging, mentre la maggiore limitazione è loro diffrazione limitata risoluzione, strutture di significato o complessi di proteine inferiori a 200-250 nm non possono essere risolto. Con lo sviluppo teorico e pratico di deterministico super-risoluzione (per esempio, microscopia di svuotamento stimolato dell'emissione (STED1), strutturato microscopia di illuminazione (SIM2) o stocastici super-risoluzione (ad es. , deplezione di fotoattivazione localizzazione microscopia (PALM3), o stato fondamentale (GSD4,5)), risoluzione assiale e laterale in microscopia a fluorescenza è stata estesa oltre la barriera di diffrazione, all'ordine di decine di nanometri. Così, gli investigatori hanno ora la possibilità senza precedenti per visualizzare e comprendere come organizzazione e dinamica di proteine si traduce in funzione al livello vicino-molecolare.
Microscopia di svuotamento di stato fondamentale seguita da ritorno di singola molecola (GSDIM), o semplicemente GSD come è noto, aggira il limite di diffrazione riducendo il numero di emettere simultaneamente fluorofori4,5. Luce laser ad alta energia è usata per eccitare l'esempio fluorophore-etichettati, bombardando gli elettroni con fotoni e aumentando la probabilità saranno sottoposte a un 'spin-flip' e inserire il tripletto o 'buio-stato' stato eccitato4. Questo impoverisce efficacemente lo stato di terra, da qui il nome «suolo lo svuotamento dello stato». In stato di tripletto, fluorofori non emettono fotoni e il campione appare dimmer. Tuttavia, questi fluorofori casualmente ritorno allo stato di terra e possono passare attraverso diversi fotoni che emettono le transizioni di stato eccitato a terra prima di ritornare allo stato di tripletto. Con meno fluorofori che emettono in un dato momento, fotone scoppi emessa da singoli fluorophores diventare spazialmente e temporalmente distinte dai vicini fluorofori. La raffica di fotoni possa essere in forma con una funzione gaussiana, il centroide calcolato che corrisponde alla posizione del fluoroforo con una precisione di localizzazione che dipenda l'apertura numerica (NA) della lente, la lunghezza d'onda della luce utilizzata per eccitazione e fondamentalmente, il numero di fotoni emessi al fluoroforo. Una limitazione di GSD è che, poiché solo un sottoinsieme dei fluorofori emette attivamente in qualsiasi momento, migliaia di immagini dovrà essere raccolti nel corso di alcuni minuti per costruire una mappa di localizzazione completa. Il tempo di acquisizione lungo combinato con il requisito di laser ad alta potenza, significa che la GSD è più adatto a piuttosto che campioni dal vivo.
Questo articolo descrive la preparazione di campioni fissati per formazione immagine di microscopia di Super-risoluzione della membrana e del reticolo endoplasmatico (ER)-proteine residenti (per un elenco dei materiali di consumo necessari e reagenti Vedi Tabella materiali). Esempi di come questo protocollo può essere facilmente adattato per quantificare la dimensione e il grado di clustering di L-tipo scanalature tensione-gated Ca2 + (Cav1.2) nel sarcolemma dei miociti cardiaci, o usato per prevedere la distribuzione cellulare dell'ER, sono dimostrati. Comprendere la distribuzione e l'organizzazione di questi componenti cellulari è criticamente importante per capire l'iniziazione, traduzione e, infine, la funzione di molte Ca2 +-cascate di segnalazione dipendente. Ad esempio, Cav1.2 canali sono fondamentalmente importante per accoppiamento, mentre il ricevitore-mediata Ca2 + rilascio dall'ER è forse la più onnipresente cascata di segnalazione in cellule di mammifero eccitazione-contrazione.
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Protocol
1. lavaggio vetrini coprioggetti
- il giorno prima dell'elaborazione del campione, pulire #1.5 vetrini coprioggetti di sonicating in una soluzione 1 M di KOH per 1 h. Questa operazione rimuove qualsiasi fluorescente contaminanti che possono essere presenti sui coprioggetti.
- Risciacquare accuratamente il KOH da lamelle con acqua deionizzata.
- Una volta puliti in KOH, conservare i coprioggetti in etanolo al 70% fino all'uso.
2. Lamelle di vetro di rivestimento
Nota: passaggi in questa sezione devono essere eseguiti in una cappa di coltura cellulare per prevenire la contaminazione.
- Utilizzare pinze per rimuovere un singolo vetrino coprioggetto da soluzione di etanolo al 70% e rapidamente fiamma per rimuovere l'eccesso. Inserire i vetrini coprioggetti in una piastra a 6 pozzetti. Se fiammeggiante in una cappa di cultura non è un'opzione, è consigliabile in autoclave i coprioggetti dopo il risciacquo con acqua deionizzata e/o sterilizzazione sotto la luce della cappa di cultura per almeno 30 min. UV
- Per facilitare l'adesione delle cellule, cappotto coprioggetti con 0,01% poli-L-lisina sterile per 1 h a temperatura ambiente.
- Aspirare il poli-L-lisina e sciacquare i vetrini coprioggetti con soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS). Asciugare all'aria e posto in frigorifero durante la notte.
- La mattina successiva, rimuovere i coprioggetti dal frigorifero e aggiungere 300 µ l di laminina, ad una concentrazione di 50 µ g/mL, per almeno 30 min a temperatura ambiente. Assicurarsi che il laminin attentamente sia collocata direttamente sul coverslip.
Nota: Questo passaggio di laminina non è necessario per cellule COS-7 o cellule HEK293 ma è richiesto per i miociti ventricolari isolati. Altre cellule primarie come cellule muscolari lisce vascolari o neuroni possono aderire meglio al collagene o fibronectina rivestito coprioggetti.
3. Preparazione delle cellule
- cellule coltivate
- crescere COS-7 celle (o linea cellulare preferito) su una piastra di coltura di 10cm in 10 mL di Dulbecco ' s per volta Eagles Medium (DMEM) cultura supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% soluzione di penicillina/streptomicina (PS). Crescere le cellule in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2.
- Quando le cellule raggiungono il 90% confluency, raccoglierle dal piatto di 10 cm ad aspirazione media DMEM e aggiungendo 5 mL di soluzione allo 0,05% tripsina-EGTA. Una volta che le cellule cominciano a arrotondare e staccare, immediatamente neutralizzare la tripsina con DMEM completati.
- Uso un 5ml pipetta sierologica per rimuovere le cellule dal piatto. Pipettare il mezzo contro la base del piatto più volte per rimuovere tutte le cellule che rimangono aderenti e distribuire omogeneamente le cellule in tutto il terreno di coltura.
- Le cellule sui piatti di cultura di 35 mm per realizzare confluency di 70% per la transfezione del piatto. Rendere il volume del mezzo nel piatto fino a 2 mL con soluzione fresca di DMEM/FB/PS. Costrutti di
- cellule COS-7 transfect con il DNA del plasmide desiderata (ad es., sec61β-mCherry plasmide), utilizzando un reagente di transfezione appropriato e secondo il produttore ' istruzioni s.
Nota: Può richiedere 24-48h per la proteina di esprimere, a seconda del plasmide e/o il reagente di transfezione utilizzato.
- Miociti ventricolari topo adulto
- isolare miociti ventricolari di topo adulto utilizzando l'ormai consolidata di metodo di Langendorff aspersione 6. Risospendere il pellet risultante dei miociti in Medium 199 (M199) completati con 2,5% FBS e 1% PS.
4. Placcatura di cellule
- cellule Transfected COS-7
- aspirare 2 mL di soluzione DMEM/FB/PS dal piatto di 35 mm e aggiungere 1 mL Ca 2 +-gratis PBS. Riporre la piastra nell'incubatore per un minimo di 2 cellule raccolto dal piatto aspirando prima il Ca 2 +-PBS e quindi aggiungendo 1 mL di soluzione allo 0,05% tripsina-EGTA gratuito.
- Una volta che le cellule cominciano a arrotondare e staccare, immediatamente neutralizzare la tripsina con 1 mL di DMEM completati. Pipettare delicatamente su e giù parecchie volte per garantire le cellule transfettate sono distribuite uniformemente in tutta la sospensione di tripsina-EGTA-DMEM 2ml.
- Piastra transfected le cellule COS-7 sui poli-L-lisina coprioggetti rivestiti ad una densità appropriata affinché le singole cellule possono essere fruite e riempiono il volume del piatto fino a 2 mL con DMEM/FB/PS (ad esempio, aggiungere 90 µ l cella sospensione per il vetrino coprioggetto quindi aggiungere µ l 1.910 completati DMEM, ricciolo piatto per distribuire uniformemente le cellule).
Nota: Le celle non è necessario essere contato ma il volume delle cellule da aggiungere ad ogni piatto variano a seconda la confluenza delle cellule. - Ritorno placcato cellule nell'incubatore di cultura cellulare durante la notte per consentire alle cellule di aderire e recuperare.
- aspirare 2 mL di soluzione DMEM/FB/PS dal piatto di 35 mm e aggiungere 1 mL Ca 2 +-gratis PBS. Riporre la piastra nell'incubatore per un minimo di 2 cellule raccolto dal piatto aspirando prima il Ca 2 +-PBS e quindi aggiungendo 1 mL di soluzione allo 0,05% tripsina-EGTA gratuito.
- Miociti ventricolari topo adulto
- aspirare miociti laminina e piastra direttamente sulle lamelle rivestite con una densità appropriata in modo che le singole celle possono essere visualizzate. Questo dipenderà la densità di cellule vitali ottenuti dall'isolamento.
- Equilibrio la sospensione cellulare in una cupola sul vetrino coprioggetti e posto in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C e 5% di CO 2 per ~ 45 min consentire adesione.
5. Fissazione delle cellule
- rimuovere cellule dall'incubatrice e aspirare accuratamente il mezzo.
- Sciacquare le celle aderenti una volta con PBS.
- Fix cellule con un fissativo ottimizzato per la singola applicazione e anticorpi.
Nota: Un criterio importante da tenere a mente quando si seleziona un fissativo è la conservazione della struttura cellulare del campione, garantendo al contempo che non esiste nessun cambiamento conformazionale dell'antigene di interesse. Ai fini di questa fissazione di protocollo con 3% paraformaldehyde/0.1% glutaraldeide (PFA/GA) e la fissazione con 100% metanolo è discusso.
- PFA/GA fissazione di COS-7 transfected le cellule esprimendo Sec61β-mCherry
- Mix 1,9 mL 16% PFA e 20 µ l 50% GA e aggiungere PBS per rendere un volume finale di 10 mL.
- Aggiungere 1 mL preparata soluzione PFA/GA ad ogni piatto di cellule e fix per 10 min a temperatura ambiente.
- Aspirare le cellule PFA/GA e lavare 3 volte con PBS.
- Lavare le cellule aderite con PBS, 5 volte per 5 minuti ciascuno. Eseguire tutti i passaggi del lavaggio in un rotatore impostato su una velocità moderata (ad es., 50 cicli al minuto).
- Successivamente, ridurre i gruppi aldeide gratuito con 1 mL di preparato fresco 0,1% massa/volume boroidruro di sodio in acqua deionizzata.
- Risciacquo cellule due volte poi lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno in PBS per rimuovere tutte le tracce del boroidruro di sodio e l'alcool produce quando reagisce con aldeidi gratis.
- Fissazione di metanolo dei miociti ventricolari topo adulto
- attentamente aggiungere 1 mL di metanolo ghiacciato al 100% per le celle. Inclinare la piastra a 6 pozzetti e dispensare il metanolo contro la parete laterale piuttosto che direttamente sul vetrino coprioggetti. Poi inclinare il piatto 6 pozzetti torna a orizzontale per consentire il metanolo lavare in modo uniforme sopra le cellule. Difficoltà per 5 min a-20 ° C.
- Aspirare le cellule fissativo e lavare 3 volte con PBS.
- Lavare le cellule aderite con PBS, 5 volte per 5 minuti ciascuno su un rotatore.
6. Bloccando il legame aspecifico
- blocco per 1 h a temperatura ambiente in soluzione bloccante (Vedi la Tabella materiali).
Nota: Varie soluzioni possono essere utilizzati per bloccare associazione anticorpo specifico non, tra cui 3% albumina di siero bovino (BSA) o siero non immune dalla stessa specie come l'anticorpo primario.
7. Rilevamento
- incubazione dell'anticorpo primario
- aspirare la soluzione bloccante. Non lavare o sciacquare.
- Preparare la soluzione di anticorpo primario come segue (Vedi punto 7.1.5): diluire l'anticorpo primario ad una concentrazione di 10 µ g/mL (o produttore ' s suggerito concentrazione) della soluzione di incubazione dell'anticorpo (Vedi la tabella materiali ). Questo piccolo volume sul coprioggetto in equilibrio e impostare con attenzione un quadrato di pellicola plastica paraffina sulla parte superiore. Questo aiuta a diffondere il piccolo volume di anticorpo sopra il vetrino coprioggetto e guardie contro evaporazione.
- Collocare la piastra 6 pozzetti in una camera umida ed incubare per una notte in frigorifero.
- Al mattino, rimuovere le cellule da camera umidostatica, attentamente rimuovere la pellicola di paraffina quadrata dalla superficie del coprivetrino e aspirare la soluzione di anticorpo primario.
- Lavare 3 volte con PBS, poi lavare 5 volte per 5 min con blocco soluzione di lavaggio (Vedi Tabella materiali) sul rotatore.
Nota: Questo protocollo utilizza i seguenti anticorpi, dell'anticorpo monoclonale di topo anti-RFP per le immagini visualizzate in Figura 2 e coniglio policlonale FP1 7 anti-Ca V 1.2 anticorpo (un regalo dal Prof. Johannes Hell, UC Davis) per immagini visualizzate in Figura 3. Per quanto riguarda la camera umidostatica, un lunch box di plastica con un coperchio a chiusura ermetica, foderato con tovaglioli di carta bagnati opere. PBS può essere usato per lavare i passaggi, tuttavia questo protocollo migliora la specificità d'etichettatura e riduce la priorità bassa con una soluzione diluita di blocco per fasi di lavaggio.
- Incubazione anticorpo secondario
- aspirare la soluzione di lavaggio e aggiungere 200 µ l di coniugato anticorpo secondario 1:1,000 di soluzione diluita in soluzione di incubazione dell'anticorpo. Inserire un quadrato della pellicola di paraffina sopra il vetrino coprioggetti (Vedi punto 7.1.2).
- Incubare per 1 h a temperatura ambiente al buio.
- Anticorpo secondario aspirare e lavare 3 volte con PBS.
- Lavare le cellule con soluzione diluita blocco 5 volte per 5 min sull'attuatore.
- Lavare 3 volte per 5 min con PBS.
Nota: Questo protocollo viene descritto l'utilizzo di anticorpo secondario coniugato anti-topo Alexa 647 e anticorpo secondario coniugato anti-coniglio Alexa 647 per Figura 2 e Figura 3, rispettivamente. Per l'etichettatura di singole proteine, Alexa 647 è il fluoroforo comodo grazie al conteggio di fotoni ad alta (migliora la precisione di localizzazione) e duty cycle basso (migliora la risoluzione temporale) 8. Molte altre opzioni di anticorpo secondario coniugato fluoroforo, come Atto o Cy-coloranti, sono disponibili. Fare riferimento a Dempsey et al. 8 e Chozinski et al. 9 per numerose possibilità di valutazione dell'idoneità dei diversi fluorofori/coloranti per l'imaging di Super-risoluzione.
8. Post-fissazione (passaggio facoltativo)
- GA di 50% di diluire 50 µ l a 10 mL di PBS per ottenere una soluzione di GA di 0,25%. Post-Difficoltà cellule per 10 min in questa soluzione a temperatura ambiente.
- Lavare con PBS 3 volte per 5 min in un rotatore.
9. Conservazione dei campioni
- conservare i campioni in frigorifero (4 ° C) in un contenitore di lamina rivestita di alluminio al riparo dalla luce fino a imaging.
- Per l'archiviazione a lungo termine dei campioni (fino a diversi mesi), memorizzare in PBS contenente azoturo di sodio 3 mM per prevenire la crescita batterica.
10. GSD super-resolution Imaging Photoswitching Buffer preparazione
- preparare il lavaggio dell'ossigeno ' GLOX ' soluzione come segue:
- In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, aggiungere 12,5 µ l catalasi (stock 34 mg/mL), 3,5 mg glucosio ossidasi e 0,5 µ l 1 M Tris (pH = 8) a 49,5 µ l di PBS.
- Vortex brevemente per sciogliere i componenti nella soluzione quindi centrifugare a 20.800 x g per 3 min a 4 ° C.
Nota: soluzioni di lavaggio dell'ossigeno come GLOX, sono stati trovati per opporsi photobleaching. GLOX dovrebbe essere tenuto in frigorifero fino a una settimana. Ripetere il passaggio di centrifuga ogni volta che viene utilizzato.
- Soluzione di tiolo di preparare la photoswitching d'induzione come segue:
- preparare la soluzione di β-mercaptoethylamine (MEA) 100mm in PBS e modificare il pH a pH 8 o, in alternativa, utilizzare β-mercaptoetanolo (βME). Conservare la soluzione di MEA aliquotati nel congelatore (-20 ° C) fino a 1 settimana.
- Immediatamente prima di formazione immagine, preparare il buffer finale di commutazione su ghiaccio aggiungendo il tiolo e ossigeno-lavaggio componenti insieme. Per 500 µ l GLOX-MEA, aggiungere 5 µ l GLOX a 50 µ l MEA (pH = 8) e 445 µ l di tampone salino (2,5 mL 1 M Tris-HCl pH = 8, 29,22 mg NaCl (concentrazione finale di 10 mM), 5 g di glucosio e 47,5 mL di acqua). In alternativa, per la soluzione di GLOX-βME aggiungere 5 µ l GLOX-5 µ l βME e 490 µ l di tampone salino.
- Mantenere le soluzioni sul ghiaccio e utilizzare necessari per montare i campioni su vetrini depressione.
Nota: Soluzioni contenenti tiolo come βME o MEA inducono photoswitching di tinture basate su cianina ad esempio Alexa 647 10 o basati su xantene coloranti come Alexa 568. ΒME produce risultati migliori con Alexa 647 mentre MEA è preferito per Alexa 568 o quando 2 proteine sono essere imaged con un doppio approccio etichettatura utilizzando sia Alexa 568 e 647. Il buffer si deteriora in un periodo di ore a causa di acidificazione. Questo porterà ad una riduzione nel conteggio del fotone media del campione. Per evitare questo, si consiglia di rendere fresca photoswitching buffer dopo 2-3 h o se si osserva un calo nel conteggio del fotone medio oppure un'estensione notevole di tempo per photoswitching indotto. Un articolo recente ha descritto un nuovo buffer imaging Ox-EA che non abbiamo ancora testato, ma secondo come riferito mostre pH stabile livelli per diversi giorni e si comporta meglio di GLOX per multi-color imaging applicazioni 11.
- Mantenere le soluzioni sul ghiaccio e utilizzare necessari per montare i campioni su vetrini depressione.
11. Esempi di montaggio
- Monte coprioggetti con cellule con etichettate (vedere paragrafi 1-9) sulla depressione scivoli, utilizzando 100 µ l tampone imaging.
- Sigillare i bordi del coprivetrino con una colla siliconica per prevenire l'ossidazione rapida del buffer imaging. Attendere alcuni minuti fino a quando la colla siliconica è completamente guarito in caso contrario il coprioggetto andrà alla deriva quando imaging.
Nota: Colla al Silicone non si indurisce se viene a contatto con βME. Assicurati di asciugare i bordi del coprivetrino per impedire che la colla siliconica contattando il buffer imaging.
12. Acquisizione immagini
- vedere la tabella 1 per un elenco dei parametri utilizzati nella Figura 2 e Figura 3 di imaging.
- Per iniziare, selezionare l'appropriato laser per illuminare il campione a seconda il fluoroforo selezionato. Il sistema SR-GSD utilizzato nel presente protocollo è dotato di laser ad alta potenza (488 nm, 1,4 KW/cm 2; 532 nm, 2,1 KW/cm 2; 561 nm, 2,1 KW/cm 2 642 nm, 2,1 KW/cm 2). Figura 2 utilizzato il laser nm 642.
- Utilizzare un obiettivo a immersione in olio con un alto NA. Il sistema SR-GSD qui utilizzato è dotato di un HC PL APO 160 X / 1,43 obiettivo NA.
- Ha scelto il cubo imaging dicroico appropriato. Il sistema SR-GSD in questo protocollo è dotato di 488 HP-T, 532 HP-T, 568 HP-T, 642 HP-T con filtri passa-banda di emissione di 505-605 nm, 550-650 nm e 660-760 nm.
- Selezionare la modalità di acquisizione 2D. Impostare la fotocamera in cornice-trasferimento modalità e tempo di esposizione di 10 ms (100 Hz). Impostare il guadagno di EM a 300. Selezionare la soglia di rilevamento.
Nota: Le soglie basse producono immagini con alta priorità bassa. Soglie elevate possono filtrare il segnale di interesse. Determinare la soglia basata su controlli negativi come imaging coprioggetti di cellule non trasfettate o cellule incubate con anticorpo secondario solo. - Attivare controllo evento automatico e impostare eventi per immagini a 8.
- Immettere la dimensione in pixel nella scheda di GSD-acquisizione (iniziare con 10 nm o dimensione dei pixel 20 nm). Assicurarsi che " istogramma modalità " è selezionata nella scheda strumenti GSD sotto le opzioni di calcolo di immagine ad alta risoluzione prima di acquisizione immagine.
- Di proteine alla membrana del plasma di immagine, selezionare la modalità TIRF e modificare l'angolo di incidenza per determinare la profondità di penetrazione.
- Per inviare gli elettroni allo stato scuro (chiamato pompaggio), impostare l'intensità del laser al 100%.
- Selezionare la rivelazione della singola molecola durante il pompaggio e impostato per acquisire automaticamente quando la correlazione della struttura è di 0,20.
- Per l'acquisizione, impostare l'intensità del laser al 50%.
- Impostare il numero di frame di acquisizione su 60.000.
Nota: Lo sperimentatore può trovare che un campione richiede più o meno fotogrammi di questo. Modificare il numero di telaio sulla base delle osservazioni del fluoroforo photobleaching e stop acquisizione quando nessun ulteriore evento è rilevabile. - Start acquisizione.
Nota: All'inizio dell'acquisizione, tutte le molecole di colorante sono nello stato fluorescente e quindi passare allo stato scuro. Quando la correlazione frame raggiunge 0,20, immagini inizierà a essere acquisito. Quando vengono rilevati meno di 8 eventi per fotogramma, il laser 405 si accenderà, incoraggiando fluorofori per la transizione dallo stato fondamentale allo stato scuro. Quando l'acquisizione di immagini per un dataset di n = x cellule da n = y animali, parametri come TIRF profondità di penetrazione, soglia di rilevamento e numero di fotogrammi acquisiti deve essere mantenuti costante.
13. Analisi dell'immagine
- per quantificare la dimensione dei cluster della proteina, utilizzare il ' analizzare particelle ' caratteristica di ImageJ.
Nota: Ulteriore analisi può essere eseguita utilizzando analisi di localizzazione relativa basata su microscopia stocastico ricostruzione ottico (STORM-RLA) o simili 13.- Eseguire analisi dei cluster ( Figura 3) usando ImageJ come segue:
- aprire il file di immagine per essere analizzati. Questo dovrebbe essere una mappa di localizzazione singola molecola di 10 nm istogramma come generata nel software di imaging descritto sopra (sezione 12).
- Regolare la luminosità e il contrasto di visualizzazione dell'immagine: fare clic su dal menu immagine, selezionare regola, quindi luminosità e contrasto. Scegliere l'opzione auto.
- Modificare il tipo di immagine a 8 bit: selezionare il menu immagine, quindi selezionare tipo e scegliere 8-bit.
- Impostare la scala dell'immagine: aprire il menu Analizza, scegliere scala impostato e inserire i seguenti parametri: distanza = 1, noto distanza = 10, 1 pixel = 10 nm.
- Per selezionare le misure ottenibili, aprire il menu Analizza, selezionare set di misurazioni e seleziona la casella accanto all'opzione di zona.
- Regolare la soglia dell'immagine. Aprire il menu immagine, selezionare regolare e quindi selezionare soglia, selezionare sopra/sotto. Spostare il valore massimo di 255 e spostare il valore minimo 1 e fare clic su Applica.
- Per analizzare le particelle, aprire il menu Analizza, selezionare analizza particelle. Inserire un segno di spunta per selezionare unità pixel, visualizzare i risultati e il riepilogo. Impostare le dimensioni di 4-infinity (dato che la risoluzione è di ~ 20 nm), selezionare l'opzione contorni nudo e fare clic su ok. Verrà creato un file di riepilogo che conterrà i dettagli di analisi come la dimensione media di un cluster e il numero di cluster nell'immagine.
Nota: Attenzione dovrebbe essere esercitata quando fare conclusioni circa il numero delle proteine all'interno di un cluster specifico, come il numero di punti localizzati non è correlata linearmente con il numero di proteine. GSD localizza coloranti che sono coniugati agli anticorpi, determinando un errore di sollevatore che sposta l'etichetta fluorescente dall'epitopo di > 10 nm in qualsiasi direzione. Inoltre, se gli anticorpi policlonali sono utilizzati, più di un anticorpo può essere associato a un singolo antigene e confondere secondario problema ulteriormente, commerciale anticorpi sono coniugati, in media, 3-6 molecole di colorante così un fluoroforo non è sempre uguale una proteina. Errore di collegamento può essere ridotto coniugando un colorante direttamente per l'anticorpo primario (eliminando il secondario) o utilizzando un regime d'etichettatura basata su nanobody 14.
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Representative Results
Come documentato nell'introduzione, ci sono molti microscopia di Super-risoluzione diverse modalità di formazione immagine. Questo protocollo, si concentra su formazione immagine di Super-risoluzione GSD. Immagini rappresentative e mappe di localizzazione sono mostrate in Figura 2 e Figura 3.
La figura 2 Mostra delle cellule COS-7 transfettate con ER proteina, mCherry-Sec61β e trattati con il metodo sopra descritto. Figura 2A -2B consentire il confronto delle immagini dell'ER prese utilizzando un microscopio di Super-risoluzione in modalità TIRF (A) e modalità di acquisizione di GSD (B). Le immagini mostrano un miglioramento della risoluzione assiale quando acquisito in modalità GSD. Ciò è ulteriormente dimostrato nel profilo della trama d'accompagnamento, che può essere generato usando ImageJ, che mostra la differenza nella distribuzione delle curve intensità normalizzata presso le aree di interesse (linea gialla). Queste curve rappresentano il diametro dei tubuli ER che sembrano essere molto più stretto quando esaminato in modalità GSD. Microscopia GSD ha una precisione di localizzazione laterale di circa 20 nm e pertanto rappresenta un aumento di circa dieci volte nella risoluzione oltre il limite di diffrazione. Questo miglioramento nella risoluzione si traduce in una rappresentazione più accurata della struttura dei tubuli ER.
Il miglioramento nella risoluzione offerti da Super-resolution imaging GSD è ulteriormente dimostrato in Figura 3, mostrando un miocita cardiaco etichettato con un anticorpo anti-Cav1.2, trattato come descritto sopra. L'immagine in Figura 3A è stato eseguito utilizzando un microscopio di Super-risoluzione GSD in ambiente TIRF. Grappoli di CaV1.2 canali possono essere visti a organizzare lungo la rete t-tubulo. Figura 3B Mostra la stessa cella, tuttavia questa immagine è stata acquisita utilizzando modalità di GSD. Il miglioramento nella risoluzione assiale è più prominente nei pannelli che si concentrano su singoli gruppi di canali (Figura 3B), quando viene effettuato un confronto tra il ROI stesso Imaging utilizzando TIRF e GSD, cluster separati dei canali sono più facili da identificare come un risultato del miglioramento nella risoluzione offerta da formazione immagine GSD. Questi pannelli anche confrontare la differenza tra la soglia di rilevamento definita come il numero di fotoni per pixel. Questo parametro deve essere scelto con cura e adattato alle esigenze dell'esperimento. Pannello 3D Mostra contorni cluster quando l'immagine GSD è stata elaborata utilizzando software ImageJ, da questa area del cluster per ogni cluster individuali nell'immagine può essere determinato (Vedi nota 13.1.8 sopra e la sezione di discussione per considerazioni importanti Quando si esegue una tale quantificazione). Queste informazioni possono quindi essere utilizzate per generare l'istogramma di frequenza nel pannello 3 C. Questa analisi può essere utilizzata per esaminare i cambiamenti nella dimensione del cluster, o il numero di cluster tra i campioni sotto controllo contro le condizioni di test (ad es., WT vs mutante canali o cellule trattate con farmaco di vs non trattati). Utilizzando gli approcci descritti in questo protocollo al fianco di esperimenti complementari photobleaching graduale, gli investigatori hanno determinato che CaV1.2 canali sono distribuiti in gruppi di, in media, 8 canali in miociti cardiaci15 .
Figura 1: rappresentazione schematica della sequenza temporale degli eventi per l'imaging di Super-risoluzione delle proteine di membrana. Giorno 0 si riferisce al primo giorno di lavorazione per l'etichettatura di anticorpo. La sezione di protocollo si riferisce alla sezione, nel protocollo, dove si trovano informazioni dettagliate su ogni passaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: microscopia di Super-risoluzione offre migliorare segnale-rumore e una maggiore risoluzione spaziale. (A) sinistra COS-7 cellule esprimenti mCherry-Sec61β, fisse ed etichettati come descritto nel protocollo e imaging utilizzando la microscopia convenzionale TIRF. Pannello di destra, in alto: singolo tubulo di ER. Pannello di destra, inferiore: tracciare il profilo ricavato su tutta la larghezza del tubulo ER (linea gialla). (B), la stessa cellula (A) tranne la localizzazione mappa è stato generato utilizzando Super-risoluzione GSD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Super-resolution imagingv1.2 dei canali del Ca in miociti cardiaci. Impronta di TIRF (A) da un isolato dei miociti cardiaci, fisso e macchiato con anti-CaV1.2 anticorpo (FP1). (B) sinistra: impronta di Super-risoluzione TIRF da stesso miocita cardiaco come in (A). A destra: ingrandimento porzioni di mappa localizzazione che sono stati sottoposti a soglie di rilevazione diverse. Si noti che come uno aumenta la soglia di rilevamento, diminuire la dimensione apparente di CaV1.2 canale cluster. (C) istogramma di frequenza di dimensioni di cluster ottenuti dalla mappa localizzazione in (B). (D) sinistra: contorni della CaV1.2 di cluster dal (B). A destra: allargate porzioni dell'immagine sono stati sottoposti a soglie di rilevamento differenti. Nota, simile a (B), man mano che aumenta la soglia di rilevamento, l'area occupata dalla CaV1.2 canale cluster diminuisce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Fluoroforo utilizzato | Alexa-647 |
| Laser | 642 nm |
| Filtri di emissione | 623 HP-T |
| Lente | 160 X 1,43 NA |
| Tempo di esposizione | 10 ms |
| Soglia di rilevamento | 65 |
| Angolo di incidenza (profondità di penetrazione) | 65,04 ° (150 nm) |
| Guadagno di EM | 300 |
| #frames acquisito | 30.000-60.000 |
| Intensità del laser per il pompaggio | 100% |
Tabella 1: Elenco dei parametri di imaging.
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Discussion
La recente esplosione di tecnologie che permettono la formazione immagine oltre il limite di diffrazione hanno offerto nuove finestre nella complessità della cellula di mammiferi segnalazione nello spazio e nel tempo. Queste tecnologie includono tempesta, STED, PALM, GSD, SIM e le loro varianti (ad es., dSTORM, FPALM). L'ingegnosità degli scienziati dietro queste tecniche ha permesso di eludere i limiti imposti dalle leggi della fisica che regolano la diffrazione della luce. Nonostante questo risultato enorme, ognuna di queste tecniche rende una sorta di compromesso per ottenere una super-risoluzione e, come tale, ha i suoi limiti. La situazione ideale che biologi delle cellule e dei biophysicists si sforzano per è acquisizione veloce, con nessun photobleaching, alta risoluzione e sensibilità ottimale. Inoltre, uno dovrebbe rimanere cosciente che rimuovendo le cellule dagli animali, intrinsecamente cambiarli e potenzialmente cambiare la dinamica molecolare. Pertanto, la ricerca per sviluppare una tecnologia di Super-risoluzione che permette dinamico, vivere delle cellule, formazione immagine di singola molecola in una vita, la respirazione animale continua. Per ora, abbiamo strumenti a nostra disposizione in grado di generare immagini con 10 volte miglioramenti sulla risoluzione di diffrazione limitata. In questo articolo, discutiamo la preparazione del campione, acquisizione di immagini e analisi per GSD che permettono risoluzioni fino a 20 e 50 nm nelle dimensioni assiali e laterali, rispettivamente.
Anche se il fuoco di questo protocollo è il Sec61β e CaV1,2 L-tipo Ca2 + canali, il protocollo descritto sopra può servire come modello per i ricercatori che desiderano proteine differenti di immagine nei propri laboratori su un microscopio GSD. Sono gli attributi positivi di questo tipo di protocollo che è relativamente semplice, può essere modificato e applicato a un numero di diversi tipi di cellule e può essere facilmente adattato a imaging multi-colore. I limiti evidenti sono quella super-risoluzione sistemi, dotati di una fotocamera di EM-CCD sensibile capace di rilevazione di singola molecola, tendono ancora ad essere proibitivi per molti laboratori.
Come aumentare il numero di laboratori che utilizzano microscopia di Super-risoluzione come loro tecnica di imaging preferito, più uniforme comprensione e accordo è necessaria su immagine acquisizione, elaborazione e interpretazione. Come, ad esempio, uno a quantificare il livello di prossimità di due proteine che appaiono colocalized in un pixel di diffrazione limitata ma trasparire per visualizzare effettivamente poca sovrapposizione affatto in una super-risoluzione immagine/mappa? Infatti, questo scenario è già sorto per diversi precedentemente assunto proteine colocalized, quali l'adesione proteine complesse paxillina e zyxin. Come la risoluzione che microscopi invariabilmente ottenere aumenti, forse proteine non saranno non più segnalate alle 'colocalize' ma piuttosto per avere in modo non casuale distribuito modelli di localizzazione preferito uno intorno a altro. Dopo tutto, è impossibile per due proteine ad occupare fisicamente esattamente lo stesso spazio 3-dimensionale. Alcune soluzioni a questo enigma di analisi stanno iniziando ad emergere nella letteratura, compreso analisi di localizzazione relativa basata su microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM-RLA), che secondo come riferito possono quantificare la frequenza ed il grado di sovrapposizione tra due co-etichettato proteine e anche fornire misurazioni quantitative della distanza tra non sovrapposte proteine13. Quando si confrontano un canale a altro in Super-risoluzione, naturalmente è fondamentale per assicurarsi di che avere corretto del registro di sistema tra i due canali. Questo può essere valutato utilizzando microsfere di multi-colore perline fluorescenti e imaging in ogni singolo canale quindi sovrapporre le immagini. Inoltre, dato che la SR-GSD microscopio 3D può anche funzionare come un microscopio TIRF e generare localizzazione di Super-risoluzione mappe in TIRF, è importante abbinare la profondità di penetrazione tra i canali di due colori, TIRF angoli di cambiare a seconda del lunghezza d'onda della luce utilizzata per eccitare il campione.
Ulteriormente, come raffigurato in Figura 3B e Figura 3D, una mappa di localizzazione può apparire molto diversa a seconda del grado di 'soglia'. Se la soglia di rilevamento è impostata troppo bassa, strutture sembra essere più grande di quanto sono realmente come la probabilità che uno include spurie contrassegno non specifico del 'rumore' aumenta. Al contrario, se la soglia di rilevamento è impostata troppo alta, quindi strutture potrebbero essere più piccole di quanto sono realmente come 'reali' eventi sono esclusi. Così, la soglia deve essere applicata con cautela e ragione. Così come può essere determinata una soglia di rilevamento ragionevole per un dato campione? I controlli sono fondamentali. Come con qualsiasi approccio immuno-etichettatura, controlli positivi e negativi dovrebbero essere effettuati per dimostrare la specificità degli anticorpi. Con controlli appropriati, è possibile derivare una soglia di rilevamento sopra il quale dovrebbe essere osservato solo etichettatura specifica. Controlli appropriati includono esempi in cui è stato omesso l'incubazione dell'anticorpo primario, quindi un campione esposto solo all'anticorpo secondario può essere osservato. Da tale controllo, il legame non specifico di un anticorpo secondario possa essere individuato. In un campione ben preparato, questo dovrebbe causare un conteggio di eventi molto più piccolo per immagine e un minor numero medio di fotoni per pixel rispetto al campione incubato primario e secondario. La soglia di rilevamento dell'immagine quindi possibile impostare affinché il contrassegno non specifico può essere eliminato. La stessa soglia di rilevamento quindi deve essere utilizzata quando il campione primario e secondario incubato per accrescere la fiducia di imaging che il 'rumore' viene eliminato. Ulteriori controlli includono quelli test la specificità dell'anticorpo primario. In cellule transfected, se la proteina marcata non è espressa in modo nativo nella linea cellulare, quindi un semplice test della specificità dell'anticorpo primario consiste nell'eseguire la procedura di etichettatura sulle cellule untransfected. Per dimostrare la specificità dell'anticorpo primario in cellule primarie, un knockout genetico della proteina etichettata è il gold standard. Soglie di rilevazione possono essere impostate anche utilizzando questi esperimenti di controllo di anticorpo primario. In assenza di antigene bersaglio, qualsiasi emissione di fluorescenza è non specifica. Come con gli unici controlli secondari, con un buon anticorpo primario, meno eventi per ogni immagine dovrebbero essere osservati e sopra lo stesso numero di fotogrammi, un più basso significa quindi numero di fotoni per pixel dovrebbe essere evidente. La soglia di rilevamento può essere impostata così su un livello che consente di eliminare sfondo aspecifici macchiatura dovuto il grippaggio dell'anticorpo primario fuori bersaglio. Per la completa trasparenza, è suggerito che gli autori presenti immagini con i relativi parametri di soglia chiaramente indicati e, forse, con un link ai dati grezzi in un onlindepositario e.
Lo sperimentatore deve anche rimanere cosciente che gli anticorpi secondari più possono associare a un singolo anticorpo primario così un rapporto di 1:1 primario: secondario associazione non dovrebbe essere assunto. Inoltre, gli anticorpi secondari commerciali comunemente sono coniugati a fluorofori più, ad esempio, gli anticorpi secondari impiegati in questo protocollo sono indicati dal fabbricante ad essere coniugati a fluorofori 2-8. Come ovviare a questo, un fluoroforo può essere direttamente coniugato con un anticorpo primario. Spettrofotometria può quindi essere utilizzato per determinare il numero medio di fluorofori per anticorpo primario. Diversi kit disponibili in commercio sono disponibili per eseguire questo processo di coniugazione. Tuttavia, anche se una stechiometria 1:1 è raggiunto, il fluoroforo molecola stessa può creare problemi ulteriori overcounting a causa del lampeggiante e commutazione reversibile di fluorofori. In pratica, questo significa che un fluoroforo può ciclo diverse volte tra la terra e stato eccitato che emettono i cluster di fotoni come lo fa. Questi fotoni possono essere rilevati in diversi pixel adiacenti e portano ad una sovrastima della dimensione cluster. Altri ricercatori hanno affrontato questo problema con la scelta di combinare fluorescente emissioni cluster in brevi periodi di tempo e spazio16,17. Si tratta di un approccio un po' empirico che ancora non elimina la possibilità che il fluoroforo stesso potrebbe ciclo torna allo stato scuro per un periodo prolungato, allora contrario ad uno stato di ciclismo/emissione una volta di più ed essere giudicato come una seconda molecola. Di conseguenza, il numero di molecole in un cluster non può essere calcolato in base esclusivamente sulla dimensione del cluster. Al momento, non esiste una perfetta soluzione per questi problemi e, di conseguenza, l'uso di formazione immagine di Super-risoluzione in combinazione con un'altra tecnica come graduale photobleaching può dare una stima approssimativa del numero di molecole per cluster. I controlli pertinenti ad accrescere la fiducia nelle misure di zona di cluster includono confrontando le dimensioni dei cluster proteine monomeriche note (ad es., CD86) e proteine dimeriche note (ad es., CTLA-4) a quelle della proteina di interesse come suggerito da Fricke et al. 18.
In sintesi, nel presente articolo, un protocollo semplice immunolabeling è impostato indietro che descrive la preparazione di campioni fissati per l'imaging di Super-risoluzione. Inoltre, alcuni problemi comuni nell'acquisizione di immagini e analisi sono discussi. Come formazione immagine super-risoluzione diventa più ordinaria, può risultare necessario per riviste di stabilire una nuova serie di linee guida per evitare la manipolazione inappropriata di queste mappe di immagini/localizzazione complessi. Microscopia di Super-risoluzione ha aggiunto un nuovo potente strumento nella casella degli strumenti dei biologi cellulari e dei biophysicists e ha già fatto un impatto straordinario sulla nostra comprensione dell'architettura cellulare e organizzazione molecolare.
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Disclosures
Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione AHA a r.e.d. (15SDG25560035). Gli autori si desidera ringraziare Dr. Fernando Santana per l'uso del suo microscopio 3D Leica SR GSD e Dr. Johannes Hell per gentilmente fornire l'anticorpo FP1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1x with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
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