Summary

Preparazione del campione per l'analisi di Endopeptidomic in liquido cerebrospinale umano

Published: December 04, 2017
doi:

Summary

Viene presentato un metodo per analisi spettrometria totale di peptidi endogeni in umana del liquido cerebrospinale (CSF). Impiegando la filtrazione di cut-off di peso molecolare, cromatografica pre-frazionamento, analisi spettrometria totale e una successiva combinazione di strategie di identificazione del peptide, è stato possibile ampliare il noto peptidome di CSF quasi dieci volte rispetto per gli studi precedenti.

Abstract

Questo protocollo descrive un metodo sviluppato per identificare peptidi endogeni in umana del liquido cerebrospinale (CSF). Per questo scopo, un metodo precedentemente sviluppato basato su filtrazione di cut-off (MWCO) di peso molecolare e analisi spettrometria totale è stato combinato con un passo di pre-frazionamento di HPLC in linea fase inversa di alto pH.

Secrezione nel CSF è la via principale per la rimozione di molecole capannone da cellule del sistema nervoso centrale. Così, molti processi nel sistema nervoso centrale si riflettono nel CSF, rendendolo un prezioso fluido diagnostico. CSF ha una composizione complessa, contenente proteine che coprono una gamma di concentrazione di 8-9 ordini di grandezza. Oltre a proteine, studi precedenti hanno dimostrato anche la presenza di un gran numero di peptidi endogeni. Mentre meno estesamente studiato rispetto alle proteine, questi potrà inoltre detenere potenziale interesse come biomarcatori.

Peptidi endogeni sono stati separati dal contenuto di proteina di CSF attraverso filtrazione MWCO. Rimuovendo una maggioranza del contenuto proteico del campione, è possibile aumentare il volume del campione studiato e quindi anche l’importo totale dei peptidi endogeni. La complessità della miscela peptide filtrato è stato risolto includendo una fase inversa (RP) HPLC pre-frazionamento passo a pH alcalino prima dell’analisi LC-MS. Il frazionamento è stato combinato con un sistema di concatenazione semplice dove 60 frazioni sono state riunite in 12, quindi potrebbe essere ridotto consumo di tempo di analisi, evitando ancora in gran parte co-eluizione.

Identificazione automatica del peptide è stato effettuato tramite tre programmi di software di identificazione di diversi peptidi/proteine e successivamente combinando i risultati. I diversi programmi erano complementari piuttosto che paragonabile con meno del 15% delle identificazioni sovrapposti tra i tre.

Introduction

Biomarcatori nel liquido cerebrospinale (CSF) ricerca attualmente stanno trasformando processi neurodegenerativi. Nel morbo di Alzheimer, la più comune malattia neurodegenerativa, che interessa oltre 60 milioni persone in tutto il mondo1,2, un tripletto di biomarcatore costituito l’amiloide beta peptide, stabilizzazione dei microtubuli proteina tau e un fosforilato forma di tau, con alta sensibilità e specificità in grado di rilevare la malattia ed è stato incluso nei criteri diagnostici ricerca3. In altre malattie neurodegenerative, come il morbo di Parkinson e la sclerosi multipla, studi di proteomica sono identificati numerosi candidati di biomarcatore, alcuni dei quali sono attualmente in corso di valutazione in studi clinici4,5 ,6.

A fianco di proteine, CSF contiene anche un’abbondanza di peptidi endogeni7,8,9,10,11,12. Che costituiscono i prodotti di clivaggio di molte proteine di cervello-derivato, questi peptidi rappresentano anche una fonte potenzialmente importante di biomarker di malattia. Per aumentare l’inventario dei peptidi endogeni identificati in CSF umano e attivare analisi di endopeptidomic di CSF in studi clinici, è stato sviluppato un metodo per la preparazione dei campioni e analisi LC-MS (una combinazione di protocollo breve è stato incluso nella Figura 1 ). L’applicazione di questo metodo in un recente studio ha provocato l’identificazione di quasi 16.400 peptidi endogeni di CSF in campioni di CSF riuniti da parecchi individui della diagnosi aspecifiche, espandendo il noto endopeptidome di CSF hanno decuplicato13. Il metodo può essere utilizzato facoltativamente in combinazione con approccio etichettatura isobarica per quantificazione.

Preparazione del campione

La principale fonte di massa di proteine nel liquido Cerebrospinale è costituenti del plasma (albumina e immunoglobuline) passando sopra il sangue cervello barriera14,15. Loro elevata abbondanza ostacola la rilevazione di componenti del campione, basso-abbondante e cervello-derivato. Peptidi endogeni possono essere facilmente separati dalle proteine ad alta-abbondanti, consentendo in tal modo un volume significativamente più grande di CSF peptide estratto per essere utilizzati per l’analisi LC-MS, consentendo la rilevazione di peptidi inferiore-abbondanti.

Nel protocollo presentato qui, filtrazione di cut-off (MWCO) peso molecolare è stato utilizzato per separare i peptidi di CSF dalla frazione proteica; un metodo che è stato utilizzato in diversi precedenti studi8,9,10,11,12,16. Il passo di filtrazione è stato seguito da un passo di pre-frazionamento RP HPLC in linea eseguito sopra un gradiente di fase mobile alto pH. Eseguendo due passaggi di RP HPLC in tandem, con pH essendo la principale distinzione, la differenza di selettività tra i due passaggi risultati principalmente da ritenzione di peptide alterata in conseguenza di peptidi differenti stati di carica. L’applicazione di pre-frazionamento ad alta pH peptide prima di LC-MS in condizioni acide ha dimostrato efficace nell’aumento del peptide identificazione17,18e anche di essere superiore a questo scopo nei complessi biologici campioni rispetto ad altre modalità separazione ortogonale19, come scambio forte gatto-ionico (SCX) e RP20. Per accorciare il tempo di analisi, è stato utilizzato uno schema di concatenazione, pool di ogni frazione dith 12 (ad es., frazioni 1, 13, 25, 37 e 49), che, a causa di alto potere risolutivo di RP HPLC, ancora in gran parte evitato co-eluizione di peptidi da diversi frazioni in LC-MS passaggio20,21.

Identificazione del peptide

Identificazione del peptide in studi peptidomica differisce da quella di studi di proteomica, in quanto nessuna scissione enzimatica può essere specificato nella ricerca nel database, e di conseguenza, tassi di identificazione sono solitamente inferiore11. Un recente studio13 ha mostrato che i tassi di identificazione per peptidi endogeni ottenuti con Sequest e mascotte sono stati migliorati sostanzialmente quando il valore predefinito algoritmo del programma rispettivo software di punteggio è stato modificato utilizzando le marcature adattivo algoritmo Percolator, che indica che il punteggi ottimali algoritmi per peptidi endogeni differiscano da quella di peptidi triptico13. In quanto Studio, identificazione basata sul sequenziamento de novo peptide automatico utilizzando il software picchi (BSI) è stato trovato per essere complementari ai motori di ricerca basati su impronte digitali agli ioni due frammento, risultante in un insieme significativamente maggiore di identificato peptidi.

Protocol

Il protocollo descritto di seguito è una versione raffinata di quello usato in uno studio precedente dove una grande quantità di peptidi endogeni sono stati identificati in umano CSF15. Aggiornamenti per il protocollo originale comportano alterazioni minori per il pre-trattamento chimico di CSF nonché ottimizzazione della sfumatura utilizzata per il non in linea pre-frazionamento di alto pH RP HPLC. Considerazioni etiche T…

Representative Results

Il metodo qui descritto è stato applicato e valutato in tre studi prima dell’introduzione del pre-frazionamento del campione (tabella 1). Il primo studio utilizzato non in linea LC per avvistare le frazioni CSF su una zolla di destinazione MALDI e 730 identificati peptidi endogeni11ha provocato. Nei due studi seguenti, etichettatura isobarica è stato impiegato. Soprattutto in un caso/controllo lo studio simultaneo per l’identificazione e caratterizzazione di biomarcatori potenziali nel CSF endop…

Discussion

L’introduzione di un passaggio di pre-frazionamento di RP HPLC alto pH per un protocollo precedentemente sviluppato per il recupero di peptidi endogeni di peso molecolare ultrafiltrazione11 ridotta complessità relativa del campione e quindi consentito per un 5 volte maggiore volume di campione da studiare. Questo, a sua volta, ha aumentato la concentrazione del sottoinsieme di peptidi presenti in ogni frazione e quindi migliorato la probabilità di rilevare peptidi abbondanti bassi.

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Molte grazie Tanveer Batth e colleghi per la consulenza in impostare il metodo di pre-frazionamento.

Quest’opera è stata sostenuta da finanziamenti dal Consiglio svedese della ricerca, la Wallström e Sjöblom Foundation, la pistola e Bertil Stohne Fondazione Stiftelse, la Fondazione di Bergwall Magnus, Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut e Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen e FoU-Västra Götalandsregionen.

I principali destinatari dei finanziamenti per questo progetto erano Kaj Blennow, Henrik Zetterberg e Johan Gobom.

Materials

 1 M Triethylammonium bicarbonate Fluka, Sigma-Aldrich 17902-100ML TEAB
 8 M Guanidinium hydrochloride Sigma-Aldrich G7294-100ML GdnHCl
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Pierce 20490 TCEP
Iodoacetamide SIGMA I1149-5G IAA
Hydroxylamine 50% (w/w) Sigma-Aldrich 457804-50ML
Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade Sigma-Aldrich 271004-2L AcN
Formic acid Fluka, Sigma-Aldrich  56302-1mL-F FA
Triflouroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-10AMP TFA
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich  30501-1L-1M NH4OH
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane Merck Millipore UFC903024 MWCO-filter
Sep-Pak C18, 100 mg Waters WAT023590 SPE-column
Resprep 12-port SPE Manifold  Restek 26077 Vacuum manifold
TMT10plex Isobaric Label Reagent Set Thermo Fisher Scientific 90110 TMT10plex
UltiMate 3000 RSLCnano LC System Dionex 5200.0356 Online sample separation
Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System Dionex IQLAAAGABHFAPBMBEZ Offline high-pH fractionation
Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX Mass spectrometer for sample analysis
Proteome Discoverer 2.0  Thermo Fisher Scientific IQLAAEGABSFAKJMAUH Proteomics search platform
Mascot v2.4 Matrix Science  -  Proteomics search engine
Sequest HT Thermo  -  Proteomics search engine
PEAKS v7.5  Bioinformatic Solutions Inc.)  -  Proteomics search engine
Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size Thermo Fisher Scientific 164535 Trap column (nano HPLC)
Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size Thermo Fisher Scientific 164942 Separation Column (nano HPLC)
Savant SpeedVac High Capacity Concentrators Thermo Fisher Scientific SC210A-230 SpeedVac/Vacuum concentrator
XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm Waters 186003566 Separation Column (micro HPLC)

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Hansson, K. T., Skillbäck, T., Pernevik, E., Holmén-Larsson, J., Brinkmalm, G., Blennow, K., Zetterberg, H., Gobom, J. Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid. J. Vis. Exp. (130), e56244, doi:10.3791/56244 (2017).

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