Summary
이 원고는 마모 입자 및 무 균 완화에 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 이상적인 동물 모델을 구성 하는 CoCrMo 입자에 노출에 의해 calvarial osteolysis murine 모델을 설명 합니다.
Abstract
마모 입자 유도 osteolysis 관절 교체 실패, 무 균 완화의 주요 원인 이지만 기본 메커니즘 불분명 남아. 검색 및 산발적 발생에 필요한 긴 후속 인 그것 병 인 ofparticle 유도 osteolysis 임상의 경우에서 평가 하기 위해 도전적 이다. 따라서, 최적의 동물 모델은 추가 연구 필요. CoCrMo 입자에 노출에 의해 설립 calvarial osteolysis murine 모델은 입자와 무 균 완화에 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 효과적이 고 유효한 도구. 이 모델에서 CoCrMo 입자 처음 높은 진공 3 전극 직류 여 되었고 50 mg/mL의 농도에서 인산 염 버퍼 염 분에 resuspended. 다음, 후 분리 하 여 두개골과 날카로운 해 부 결과 서 스 펜 션의 50 µ L murine calvaria의 중간에 적용 되었습니다. 2 주 후, 생쥐 희생 했다, 및 calvaria 표본 수확 했다; 질적 및 양적 평가 되며 고 오신 얼룩 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영에 의해 수행 되었습니다. 이 모델의 장점 절차 단순, 뼈 손실의 양적 평가, osteolysis 개발, 잠재적인 사용 유전자 변형 또는 녹아웃 모델, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용의 속도 포함 한다. 그러나,이 모델은 기계적인 힘 및 입자 무 균 완화의 만성 효과 평가 하는 데 사용할 수 없습니다. Calvarial osteolysis murine 모델 CoCrMo 입자에 노출에 의해 생성 된 마모 입자 및 다양 한 셀, 예를 들면, 대 식 세포, 섬유 아 세포, osteoblasts 및 osteoclasts, 무 균 완화에 사이 상호 작용을 평가 하기 위한 이상적인 도구입니다.
Introduction
가장 일반적인 원인은 이다 무 균을 풀면 총 엉덩이 관절 (THA) 교체 및 총 무릎 관절 (TKA) 교체 실패의 개정 수술1필요. 그러나, 기본 메커니즘 불분명2남아 있습니다. 긴 후속 입자 유도 osteolysis, 그 발생은 드문; 검색 하는 데 필요한 따라서, 그것은 임상의 경우에서 자사의 pathogenesis 탐험 도전 이다. 따라서, 복잡 한 세포와 조직 메커니즘에 초점을 맞추고 더 연구에 실험 비보에 모두 착용 입자 유도 osteolysis 모델 및 분석 실험 체 외에 세포 항상성3뼈에 관련 된 필요 합니다. 유효한 동물 모델 더 세포질 분석 실험에 대 한 증거를 제공 하는 뼈 손실에 마모 입자의 효과 드러내는에서 중요 하다.
CoCrMo 입자에 노출에 의해 건설 murine calvarial osteolysis 모델 입자와 무 균 완화에 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 효과적이 고 유효한 방법입니다. 이 모델에서 CoCrMo 입자 발생할 calvarial osteolysis 유도 하는 대 식 세포에서 염증 성 cytokines, osteoclasts 활성화, osteoblast 확산 억제 및 osteoblast apoptosis를 홍보.
그것은이 모델을 설정 하려면 2 주 걸립니다. Osteolysis 수 수 시각 hematoxylin와 오신 (H & E) 얼룩 계량 및 마이크로 계산 된 단층 촬영 (마이크로 CT)2. 또한,이 모델은 상대적으로 저렴 한 비용, 그리고 유전자 변형 및 녹아웃 마우스 모델 다양 한 복용량3화합물의 많은 화면을 사용할 수 있습니다.
설정 하 고이 모델을 평가 절차는 간단 합니다. 첫째, CoCrMo 입자 높은 진공 3 전극 직류 여 되었고 50 mg/mL의 농도에서 인산 염 버퍼 염 (PBS)에서 resuspended. 다음, 후 분리 하 여 두개골과 날카로운 해 부 결과 서 스 펜 션의 50 µ L murine calvaria의 중간에 적용 되었습니다. 쥐 2 주 후, 희생 했다 및 calvaria 샘플 수확 했다; 질적 및 양적 분석 H & E andmicro-코네티컷 얼룩에 의해 수행 되었다
CoCrMo 입자에 노출에 의해 건설 murine calvarial osteolysis 모델 CoCrMo 입자와 대 식 세포, 섬유 아 세포, osteoblasts, osteoclasts에 무 균 완화 등 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 이상적인 도구입니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 난징 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. CoCrMo 입자 준비
- 조작된 높은 진공 3 전극 직류4를 사용 하 여 CoCrMo 입자를 얻을. 10-3 Pa 진공, 0.04 MPa 아르곤 및 수소 3:2 (v/v), 악기에서 장소 CoCrMo 합금 그리고 현재 650 A 음극 선.
- CoCrMo 입자의 직경을 측정 합니다.
- 무수 에탄올의 1.5 mL에 CoCrMo 입자의 1 밀리 그램을 추가 합니다.
- 무수 에탄올에 초음파 진동 28 kHz, 600 W 5 분에 의해 CoCrMo 입자를 resuspend.
- 전송 전자 현미경 (TEM)의 객관적인 테이블에 결과 현 탁 액의 한 방울 (약 20 µ L)를 적용 합니다. 200 kV 가속 전압 및 0.24 nm 해상도에 가장 사진 시리즈를 캡처하십시오.
- TEM 현미경 사진에서 평균 직경 및 입자 크기 분포를 계산 하기 위해 제공 된 소프트웨어를 사용 합니다.
- 오염을 부유
- 고압 121 ° C와 15 psi에서 15 분 동안 입자의 50 g.
- Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 양적으로 독 검색 (< 0.25 %EU / mL 내 부재를 나타내기 위해 여겨졌다)5.
- 재고 솔루션650 mg/mL의 농도에서 인산 염 버퍼 염 (PBS)에 입자를 resuspend.
2입니다. Calvarial Osteolysis 모델의 건설
- 6 주 된 C57BL/J6 쥐 (그룹 당 6 쥐) withpentobarbital (50 mg/kg) anesthetize 핀치 테스트를 사용 하 여 마 취의 수준을 평가 하기 위해. 일반적인 염 분으로 눈의 건조를 방지 합니다.
- 경향이 위치에서 마우스를 놓습니다. 두개골에 모피는 면도기로 제거 하 고 75%의 에탄올을 포함 하는 의료 면봉을 사용 하 여 피부를 소독.
- 포인트 지역화, 각각 두 눈과 귀 사이의 중간점을 포함 하 여 2 포인트를 식별 합니다. 다음, 포인트, 위의 두 사이의 라인을 확인 하 고가 위 (그림 1A)와 위의 라인을 따라 피부를 incise.
- 메스 (그림 1B)6calvaria에서 두개골과 제거 합니다.
- 간단한 중단된 봉합으로 양쪽 끝에 봉합 피부.
- 노팅 없이 절 개의 중간을 통해 봉합 라인을 확인 합니다. 봉합 선의 두 끝을 잡으십시오.
- Calvarias (그림 1C)2의 한가운데에 CoCrMo 입자 현 탁 액 (PBS에 50 mg/mL)의 50 µ L를 포함 합니다.
- 간단한 중단된 봉합 (그림 1D) 내 마지막 스티치 매듭
- 또 다른 2 주 동안 마우스를 유지.
3. 마이크로-CT 스캔 하 여 Calvarial Osteolysis 모델의 평가
- 이산화탄소와 쥐를 희생. 수평 평면에 쥐 목을 벨. 뇌 조직 내부, 그리고 피부를 제거 하 고 밖에 서 모피. 추가 실험을 위한 calvarias을 수확.
- 부드럽게 핀셋으로는 calvaria에 모든 연 조직 정리. 마이크로-CT 검사 전에 PBS 24 h calvarias 24 h. 담가 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 지운된 calvarias을 수정.
- 마우스 calvarias 18 µ m의 아이소메트릭 해상도 및 45의 x 선 에너지 설정에서 고해상도 마이크로-CT 분석 kV 및 550 mA.
- 소프트웨어와 마이크로-CT 데이터의 3 차원 재구성을 수행 합니다.
- 정성 및 정량 분석입니다.
- 먼저, 관심의 영역으로 중간 봉합 사 주위의 사각형 영역을 선택 합니다.
- 둘째, 뼈 미네랄 밀도 (BMD)를 측정, 볼륨/총 뼈 볼륨 (BV/TV), 배수 수 (Tb.N), 배수 두께 (Tb.Th), 배수 분리/간격 (Tb.Sp), 그리고 마이크로-코네티컷에 대 한 제공 된 소프트웨어와 함께 총 다공성의 비율
- 셋째, 일방통행 ANOVA에 의해 다양 한 측정을 위한 3 개 그룹을 비교할 수 있습니다. 포스트 hoc 분산 분석 적용 Bonferroni 방법2.
4. Calvarial Osteolysis 모델 H & E 염색 법의 평가
- 15% 에틸렌 diamine tetraacetic 산 (EDTA) calvaria 샘플을 알려줍니다-4 ° c.에서 PBS 3 주 동안 매일 decalcification 솔루션을 변경 합니다.
- 2 cm x 1 cm x 1 cm 큐브, 파라핀에 석된 샘플을 포함 하 고 입자 증 착의 영역에서 2 µ m 섹션으로 그들을 슬라이스.
- 되며 섹션 얼룩 하 고 오신 앞7에서 설명한.
- 가벼운 현미경 검사 법에 의해 전체 pathomorphism의 현미경을 캡처하십시오.
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Representative Results
사내 생산된 nanoscale CoCrMo 입자 했다 약 50 nm (3.56의 표준 오차) 직경, 가장 (그림 2)에 의해 정량으로. 마우스 calvarias의 CoCrMo 입자, 동물에 노출 된 후 (n = 그룹 당 6) 또 다른 2 주 동안 유지 되었다. 2 주 이내에 calvarial 절 개는 완전 하 게 치유 하 고 봉합 떨어질 수 있습니다. 모든 로컬 감염 또는 뼈 손실 평가 영향을 없앤 5 월. 마우스 희생 후 calvaria 샘플 수확 했다. 그리고, 모든 부드러운 조직을 부드럽게 정돈 했다 마이크로 CT 뼈 손실을 측정 하는 데 사용 되었다. 3 차원 재구성 이미지와 횡단면에 대표적인 코로나 사진에서 중요 한 뼈 손실은 CoCrMo 입자 (그림 3)으로 치료 하는 쥐에서 관찰 되었다. 뼈 미네랄 밀도 (BMD), 뼈 볼륨/총 볼륨 (BV/TV), 배수 수 (Tb.N), 및 배수 두께 (Tb.Th) 현저 하 게 감소 되었다, 총 다공성 및 배수 분리/간격 (Tb.Sp)는 CoCrMo에서 크게 증가 했다 그룹 제어 및 가짜 작업 그룹 (그림 4)와 비교. 학생 t 테스트 그룹와 p의 차이 평가 하는 데 사용 되었다 < 0.05 통계적으로 중요 하 게 고려 되었다. 또한, H & E 염색 calvaria 섹션의 CoCrMo 입자 (그림 5)로 치료 하는 쥐에 있는 뼈 손실 확인.
그림 1 : 입자 유도 osteolysis (PIO) 마우스 모델의 도식. 왼쪽은 모델링에서 마우스 위치를 보여준다. (A) 지역화 포인트. 두 눈과 귀 사이의 중간점을 각각 결정 하 고 그들 사이 선 따라 피부를 incise. (B) 고는 calvaria에서 두개골과 제거. (C) 포함 CoCrMo 입자 현 탁 액은 calvaria 중간. 간단한 중단된 봉합에 ((D)) 봉합 피부. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 전송 CoCrMo 입자의 전자 현미경 스캐닝. (A) CoCrMo 입자의 대표 전송 전자 현미경 이미지. (B) CoCrMo 입자의 입자 크기 분포는 소프트웨어와 함께 정량 했다. 각 막대는 입자의 총 수를 정상화 하는 주파수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 제어 마우스 및 그에서 샘플의 3 차원 개조와 마이크로 CT 분석 치료 PBS (가짜 동작)와 CoCrMo 입자. 흰색 가로줄 횡단면 이미지의 위치를 나타냅니다. 흰색 화살표 CoCrMo 주입 그룹에서 뼈 손실을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 3 차원 재구성 후 마이크로-CT 이미지의 정량 분석. 뼈 미네랄 밀도 (BMD) (A), 뼈 볼륨/총 거래량 (BV/TV) (B), 총 다공성 (C), 배수 수 (Tb.N) (D), 배수 두께 (Tb.Th) (E)의 비율의 정량화 및 배수 분리/간격 (Tb.Sp) (F), mean±standard 오류에. 학생 t 검정 p 그룹 간의 차이 평가 하는 데 사용 되었다 < 0.05 통계적으로 유의 한 것으로 간주. * *, P < 0.01; P < 0.001. n = 그룹 당 6 쥐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : H 조 & 전자 제어 마우스 및 그에서 calvaria 샘플 (10 ×)의 얼룩의 대표 이미지 치료 PBS (가짜 동작)와 CoCrMo 입자. 빨간색 화살표 osteolysis를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
마모 입자 유도 osteolysis 쥐에 대 한 두 가지 주요 방법이 있다: 공기 주머니 모델과 calvarial osteolysis 모델. 공기 주머니 모델에서 피하 생성 된 공기 주머니는 처음 설립, 마모 입자 소개 및 이식 뼈 조직8에 이어서. 주머니 벽 무 균 완화에 모방합니다. 그러나, 뼈 이식이 이다 nonvascular 생물 학적 활동 없이, 입자와 뼈 조직 간의 직접적인 상호 작용을 평가 하기 어렵습니다. Calvarial osteolysis 모델 공기 주머니 대응 이상의 몇 가지 이점이 있다. 첫째, 마모 입자는 직접 노출 calvaria, 마모 입자 간의 상호 작용을 평가 하 고 항상성, 뼈 재흡수, 그리고 osteoblast, osteoclast 및 대 식 세포 활동9,10 포함 하 여 뼈를 가능 하 게 하 . 둘째, 뼈 손실의 양적 측정 뼈 손실 예방11다양 한 잠재적인 유전 접근 및 생물 학적 에이전트의 평가 허용 사용할 수 있습니다. 셋째, 마모 입자와 다양 한 유전자, 유전자 변형 등 배경과 유전자 녹아웃 쥐12,13에 뼈 손실의 관계를 평가 하기 위해 가능 하다. 넷째, 다양 한 복용량에서 화합물의 많은 화면을 사용할 수 있습니다. 그러나, traditionalcalvarial osteolysis 모델의 상대적으로 낮은 이며 객관적인1적은 결과 만드는 osteolysis 측정 하 뼈 histomorphometry을 사용 하 여.
모델의 향상과 더 객관적 결과 렌더링, 몇 가지 수정은 했다. 첫째, 나노 입자는 calvaria 간의 상호 작용을 강화 하 고 입자를 착용을 사용 했다. 실제로, 나노 입자와는 calvaria 간의 상호 작용 1.5 µ m14,15의 평균 직경 상업적으로 합금 입자에 비해 향상 됩니다. 둘째,는 calvaria에 1.0 c m2 지역은 calvaria의 적절 한 노출을 달성 하는 구분 된 했다. 셋째, 마이크로-CT 및 3 차원 재구성 뼈 손실을 계량에 사용 되었다.
현재 모델에 몇 가지 제한이 있습니다. 마우스에 대 한 첫 번째, 마이크로-CT 장비는 연구자, 널리 사용할 수 없습니다 그리고 기술자 검사 및 3 차원 재구성 필요 합니다. 둘째, 현재 모델에 사용 된 CoCrMo 나노 입자는 상업적으로 사용할 수, 그리고 그들의 생산에서 재료 과학 기술자 지원에 의존. 셋째,이 모델 뼈 질량, 입자의 만성 효과 나타내지 않는 고 진동 유체 압력 또는 기계적인 힘 등 osteolysis에 관련 된 비 생물 요소를 결여. 모델의 효능 나노 입자의 도움과는 calvaria의 충분 한 노출 크게 증가 될 수 있습니다. 뼈 손실 양이 정해질 수 있는, 그리고 마이크로-코네티컷 더 객관적인 데이터 취득
CoCrMo 입자에 노출에 의해 설립 calvarial osteolysis murine 모델 CoCrMo 입자와 대 식 세포, 섬유 아 세포, osteoblasts osteoclasts에 무 균 완화 등 다른 세포 사이 상호 작용을 평가 하기 위해 이상적인 도구입니다. 또한,이 모델을 사용 하 여 무 균 완화에 그들의 효과의 약품의 시리즈를 테스트할 수 있습니다.
이 절차의 많은 중요 한 단계가 있습니다. 첫 번째는 50의 평균 직경 CoCrMo 나노 입자의 응용 nm. 둘째,는 calvaria의 적절 한 노출을 달성 했다. calvaria에 1.0 c m2 지역 충분이 모델, 그리고 신중 하 고 완전히 해 부 수 한다는 calvaria에과. 과의 명확한 해 부 강렬 calvaria 고 입자 사이 상호 작용. 셋째, 마이크로 CT, 뼈 손실의 양적 측정 가능 하다. 3 차원 재구성, BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp 및 총 다공성의 비율 등에서 뼈 손실의 양적 측정 쉽게 다양 한 치료, 뼈 손실 차이 구별 하 고의 확실 한 증거를 제공 osteolysis 전통적인 뼈 histomorphometry와 비교입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 (81572111), 과학 및 기술 프로젝트 재단의 장쑤 성 (BL2012002), 과학 연구 난징 프로젝트 (201402007), 자연 과학에 의해 지원 되었다 장쑤 성 (BK20161385)의 기초 그리고 중국 의사 협회 (2015COS0810)의 특별 한 기초.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
Paraffin | Servicebio | #0001 | |
Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
Glass slide | Servicebio | G6004 | |
Cover glass | Servicebio | 200 | |
HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
Light microscope | Nikon | E200 |
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