Этот протокол описывает Роман трехмерных в vitro модель, где роговицы стромальные клетки и дифференцированной нейрональные клетки культивировали вместе для оказания помощи в рассмотрении и понимания взаимодействия типов двух клеток.
Тканевая инженерия получила значительное признание из-за высокого спроса на человека роговицы замены с примерно 10 миллионов человек во всем мире, страдающих от роговицы зрение потери1. Для удовлетворения спроса на жизнеспособного человека роговицы, значительный прогресс в трехмерной (3D) ткани инженерных сделал2,3,4. Эти роговицы модели варьируются от простых монослоя систем многослойных моделей, ведущих к 3D полный Толщина роговицы эквиваленты2.
Однако использование 3D инженерии тканей роговицы в контексте в vitro модели заболеванием учился дата отсутствует сходство структуры многослойного 3D ткани роговицы, функции и сетей различных типов клеток (то есть, нерв, эпителий, строма и эндотелием)2,3. Кроме того возрос спрос на в vitro модели ткани роговицы в попытке уменьшить животных испытаний фармацевтической продукции. Таким образом чтобы лучше соответствовать систем для физиологических потребностей человека требуются более сложные модели, и развитие модели, которая является более актуальной для популяции пациентов является абсолютно необходимым. Учитывая, что несколько типов клеток роговицы, пострадавших от заболеваний и дистрофии, как кератоконус, диабетическая Кератопатия и Фукс, эта модель включает в себя 3D Сопредседатель культуры модель первичной роговицы фибробластов (HCFs) от здоровых доноров и нейроны от SH-SY5Y линия клетки. Это позволяет нам в первый раз для изучения взаимодействия между типами две ячейки в пределах человеческой ткани роговицы. Мы считаем, что эта модель может потенциально вскрыть основные механизмы, связанные с взаимодействия стромальные нервных заболеваний роговицы, которые демонстрируют повреждения нерва. Эта 3D модель зеркала основных анатомических и физиологических характер ткани роговицы в естественных условиях и может использоваться в будущем как инструмент для расследования роговицы дефектов, а также проверки эффективности различных агентов до животных тестирования.
В человеческом теле роговицы является наиболее плотно иннервируемые ткани. Нервы отвечают за различные ощущения, как прикосновение, боль, температура, а также играют важную роль в заживление ран, мерцание рефлексов, слезу производства и секреции5,6,7. В роговицы стромы нервных стволов возникают из послабляющие сплетения и радиально введите периферийных стромы роговицы. Стромальные нерв Организации параллельно с ламелями коллагена и они далее филиала в небольших брошюр, как они приступили к поверхностным стромы5,8. Нервных волокон далее проникать эпителиального пласта и таким образом, иннервация широко разбросаны по эпителия роговицы и стромы. Таким образом иннервации имеет важную роль в здоровых и больных состояние роговицы. В этом протоколе мы выявляем улучшения модели Роман 3D в пробирке , который является первым в своем роде для имитации взаимодействия стромальные нерва в естественных условиях . SH-SY5Y линия клетки была использована для этого исследования, как это один из самых известных, хорошо характеризуется линий, используемых для изучения нейрональных роста. SH-SY5Y клеточная линия была описана производить как сторонник субстрата (S-тип) и neuroblastic (N-тип) клетки, которые могут пройти transdifferentiation9. В результате даже несмотря на то, что эта линия клетки является производным от тройной последовательных subclone выбор N-типа клеток, он также содержит небольшое количество S-тип клеток, способных проходят дифференцировку в нейронах с помощью ретиноевой кислоты и мозга, полученных нейротрофических факторов9. Это представляет собой инструмент, который может привести к более глубокому пониманию роговицы осложнений, связанных с диабетической ретинопатии (DM) и других глазных заболеваний. Из-за трудностей, связанных с получением и культивирования нейроны от пациентов с глазной болезни эта модель 3D в vitro обеспечивает существенные последствия в изучении взаимодействия нейронов и сигнализации с стромы роговицы.
Часто больные условия влияют на различных тканях тела в очень больших масштабах, ведущих к угрозу качеству жизни. Глазной дистрофии являются общие осложнения часто ассоциируется с системными заболеваниями и привести к Потеря остроты или даже постоянного видения. Всеобъемлющие исследования часто необходимы для лучшего понимания состояния болезни, а также воздействие на клеточном уровне базальных. Для изучения последствий таких заболеваний, были разработаны различные модели в естественных условиях и в пробирке с помощью ткани, инженерных приложений. Ткани роговицы инженерных приложений имеют получил большой интерес в различных областях науки10,11,12,13,14, но есть еще крупные ограничения во время практического применения, включая роговицы графт отказов, инфекции и рубцов10,11,12,,1314. Есть несколько исследований, которые успешно разработаны и созданы различные в vitro модели3,,1516,17,18, 19,20,21,,2223,24,25,26. Модели 3D в vitro являются наиболее перспективных и большой научный интерес. 3D модели известны лучше зеркало в vivo сотовой и физиологических событий, которые являются критическими во время фиброз и ранение исцеления15,27,,28–29. Эти модели в vitro играют важную роль в поиске новых терапевтических подходов для лечения различных заболеваний включая роговицы осложнений. Несмотря на решающую роль иннервации роговицы функций был достигнут мало усилий для поощрения распространения периферических нервов в течение роговицы ткани инженерных конструкций2,3. Однако предлагаемые 3D в пробирке клеток конструкции имитировать ткани-мишени для достижения желаемого ткани функциональность.
В то время как диабетическая Кератопатия очевидное применение для модели, описанные здесь из-за дефектов нейронов, существует несколько других заболевания роговицы, которые могут принести пользу от человека в vitro модели, включая кератоконуса и Фукс дистрофии. Наши 3D модель выходит из этой перспективы и предлагает развитие представительства в vitro ткани роговицы оценить доставки лекарств и безопасность новой глазной лекарств.
Несколько исследований были сосредоточены на разработке различных животных моделей, которые могут помочь в разработке более глубокого понимания заболевания роговицы, а также обнаружить лечения. Однако важное значение для людей из этих исследований не была проверена. На сегодняшний д…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы выразить искреннюю признательность д-р Бен Фаулер за его техническую помощь ТЕА экспериментов.
Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
Wax block | VWR | 50-949-027 | |
SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |