Eine allgemeine Methode zur Erkennung von Nitrosamide Formation in der In-vitro- Metabolismus von Nitrosaminen durch Cytochrom P450s
Summary
Α-Hydroxylierung von krebserregenden Nitrosaminen durch Cytochrom P450s ist der anerkannte Stoffwechselweg, der DNA-schädigenden Zwischenprodukte, produziert die Mutationen verursachen. Neue Daten gibt jedoch weitere Oxidation zu Nitrosamides auftreten kann. Wir beschreiben eine allgemeine Methode zur Erkennung von Nitrosamides aus in-vitro- Cytochrom P450-katalysierte Metabolismus von Nitrosaminen hergestellt.
Abstract
N-Nitrosamine sind eine gut etablierte Gruppe Umwelt Karzinogene, die Oxidation von Cytochrom P450 Aktivität zeigen erfordern. Die akzeptierteste Mechanismus der Stoffwechselaktivierung beinhaltet Bildung von α-Hydroxynitrosamines, die spontan an DNA alkylierende Agenten zu zerlegen. Ansammlung von DNA-Schäden und die daraus resultierende Mutationen kann letztlich zu Krebs führen. Neue deutet darauf hin, dass α-Hydroxynitrosamines weiter zu Nitrosamides processively von Cytochrom P450s oxidiert werden können. Da Nitrosamides in der Regel stabiler als α-Hydroxynitrosamines sind und auch DNA Alkylat können, kann Nitrosamides in Krebsentstehung eine Rolle spielen. In diesem Bericht beschreiben wir ein allgemeines Protokoll für die Bewertung der Nitrosamide Herstellung von in-vitro- Cytochrom P450-katalysierte Metabolismus von Nitrosaminen. Dieses Protokoll nutzt eine allgemeine Ausrichtung zur Synthese der relevanten Nitrosamides und eine in-vitro- Cytochrom P450 Stoffwechsel Assay mit flüssiger Chromatographie-Nanospray Ionisierung-hohe Auflösung Tandem-Massenspektrometrie zur Erkennung. Diese Methode erkannt N′– Nitrosonorcotinine als kleine Stoffwechselprodukt von N′– Nitrosonornicotine in der Beispiel-Studie. Die Methode hat hohe Empfindlichkeit und selektiv durch genaue Masse Erkennung. Anwendung dieser Methode auf eine Vielzahl von Nitrosaminen Cytochrom P450 Systeme können die Allgemeingültigkeit dieser Transformation zu bestimmen. Da Cytochrom P450s polymorph sind und in der Aktivität variieren, konnte ein besseres Verständnis der Nitrosamide Bildung in einzelnen Krebs-Risiko-Bewertung helfen.
Introduction
N-Nitrosamine sind eine große Klasse von Karzinogenen gefunden in der Ernährung, Tabakwaren und das allgemeine Umfeld; Sie können auch im menschlichen Körper1endogen gebildet werden. Mehr als 300 N –Nitrosoverbindungen wurden getestet und > 90 % wurden als krebserzeugend in Tiermodelle2,3. Um ihre Karzinogenität aufweisen, müssen diese Verbindungen zunächst durch Cytochrom P450s1,2,3aktiviert werden. Die Forschung zeigt, dass Cytochrom P450s oxidieren leicht Nitrosamine, α-Hydroxynitrosamines (Abbildung 1), die sind hochreaktive Verbindungen mit Halbwertszeiten von ~ 5 s vor spontan zerlegen, Alkyldiazohydroxides. Letzteres kann DNA nach dem Verlust von H2O und N2Alkylat. Die daraus resultierende DNA Addukte, wenn verstopft, kann dazu führen, dass Mutationen, die bei kritischen Onko- oder Tumor-Suppressor-Gene, zu Krebs Entwicklung1führen. Aus diesem Grund, um ein umfassendes Verständnis der Stoffwechselwege zu erwerben wurde viel Aufwand betrieben wurde, DNA-Addukten, und nachgelagerten Metaboliten von Cytochrom P450-Oxidation von krebserregenden Nitrosaminen. Dieses Wissen hat mögliche Anwendung in einzelnen Krebs Risiko Bewertung4.
Abbildung 1: Allgemeine und vorgeschlagenen Stoffwechsel von Nitrosaminen.
Nitrosamine (1) werden durch P450s, α-Hydroxynitrosamines (2) oxidiert, die spontan zu Alkyldiazohydroxides (3) zerlegen. Diese Verbindungen können an DNA zu binden, die DNA Addukte. Es wird vermutet, dass 2 werden weiter durch P450s Nitrosamides 4oxidiert. Diese können direkt an der DNA in Form binden, die neuartige DNA Addukte oder 3 zu bilden, die bekannte DNA Addukte hydrolysiert werden. R1 und R2 repräsentieren jede Alkylgruppe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Obwohl die α-Hydroxynitrosamine-Hypothese fest von umfangreichen Daten unterstützt wird, gibt es ein paar Ungereimtheiten; einem großen ist die kurze Halbwertszeit von α-Hydroxynitrosamines5,6. Es ist bekannt, dass diese Verbindungen an der Membran des endoplasmatischen Retikulum hergestellt werden und später Zellkern-DNA Alkylat. Angesichts ihrer Lebenszeit von ein paar Sekunden, ist es rätselhaft, wie diese Zwischenprodukte überleben erforderlichen Reise aber die Zellflüssigkeit. Eine Hypothese ist, dass ein Teil der α-Hydroxynitrosamines sind processively oxidiert, Nitrosamides7,8, die sind ziemlich stabil im Vergleich9. Dies würde vermutlich über Vorratsspeicherung von α-Hydroxynitrosamines im Cytochrom P450 aktiven auftreten. Präzedenzfall für diese Art der Oxidation ist mit Nikotin10, Alkohole11und einfache Alkylnitrosamines12,13gesehen worden. Darüber hinaus sind Nitrosamides direktwirkenden Karzinogene2,3. Basierend auf ihre Reaktivität9, werden diese Verbindungen geglaubt, produzieren DNA Addukte identisch mit denen aus α-Hydroxynitrosamines zusammen mit neuen, unerforschten DNA Addukte (Abbildung 1). So, diese Hypothese erklärt nicht nur den Transport durch das Zytosol, sondern auch die Bildung von DNA Schäden an Produkten.
In diesem Papier wird ein allgemeines Protokoll für die Beurteilung der in-Vitro -Cytochrom P450-vermittelte Umwandlung von Nitrosaminen in Nitrosamides beschrieben. Die bisher gemeldete Umwandlung von N′– Nitrosonornicotine (NNN), N′– Nitrosonorcotinine (NNC) von Cytochrom P450 2A6 ist als ein Beispiel14präsentiert. Anwendung dieses Protokolls zu einer Vielzahl von Enzym-Substrat-Systeme helfen, die Bedeutung der Nitrosamides im gesamten Nitrosaminen Stoffwechsel festzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufklärung des Stoffwechsels von Nitrosaminen ist eine wichtige Komponente für das Verständnis ihrer Karzinogenität. Da die beteiligten Cytochrom P450s und andere metabolische Enzyme polymorph sind, konnte weitere Anwendung dieses Wissens potentiell risikoreiche Einzelpersonen1,4identifizieren. Neue Daten gibt an, dass weitere Oxidation von α-Hydroxynitrosamines, die mutmaßlichen Hauptmetaboliten von Nitrosaminen DNA-Bindung beteiligt, Nitrosamides ist mög…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschuss keine. CA-81301 vom National Cancer Institute. Wir bedanken uns bei Bob Carlson für redaktionelle Unterstützung, Dr. Peter Villalta und Xun Ming für Massenspektrometrie Unterstützung in der analytischen Biochemie geteilt Ressource des freimaurerischen Cancer Center und Dr. Adam T. Zarth und Dr. Anna K. Michel für ihre wertvollen Diskussionen und Input. Die analytische Biochemie gemeinsame Ressource wird teilweise unterstützt durch National Cancer Institut Krebs Center Support Grant CA-77598
Materials
| Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
| Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
| D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
| Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
| 0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
| 100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
| 125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
| 25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
| LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
| Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
| NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
| P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
| Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
| RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
| Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
| Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
| PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
| Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |
Riferimenti
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