Un metodo generale per la rilevazione Nitrosamide formazione nel metabolismo In Vitro di nitrosammine di citocromo P450s

Summary

Α-idrossilazione di nitrosamine cancerogene dal citocromo P450s è accettata via metabolica che produce intermedi danneggiano il DNA, che causano mutazioni. Tuttavia, nuovi dati indicano ulteriore ossidazione a nitrosamides può verificarsi. Descriviamo un generale metodo per la rilevazione nitrosamides prodotta da in vitro metabolismo del citocromo P450-catalizzata di nitrosammine.

Abstract

N-nitrosammine sono un gruppo ben consolidato degli agenti cancerogeni ambientali, che richiedono l'ossidazione del citocromo P450 per esibire l'attività. Il meccanismo di attivazione metabolica accettato coinvolge la formazione di α-hydroxynitrosamines che si decompongono spontaneamente agli agenti alchilanti del DNA. Accumulazione di danno del DNA e le mutazioni risultante in ultima analisi può portare al cancro. La nuova prova indica che α-hydroxynitrosamines può essere ulteriormente ossidata a nitrosamides processively dal citocromo P450s. Poiché nitrosamides sono generalmente più stabili di α-hydroxynitrosamines e anche possibile alchilare il DNA, nitrosamides possono svolgere un ruolo nella carcinogenesi. In questo rapporto, descriviamo un protocollo generale per valutare la produzione di nitrosamide da metabolismo P450-catalizzata-citocromo in vitro di nitrosammine. Questo protocollo utilizza un approccio generale alla sintesi del nitrosamides pertinenti e un in vitro del citocromo P450 metabolismo test utilizzando la spettrometria di massa tandem di cromatografia a fase mobile liquida-nanospray ionizzazione-alta risoluzione per il rilevamento. Questo metodo ha rilevato N′- nitrosonorcotinine come un metabolita secondario di N′- nitrosonornicotine nello studio di esempio. Il metodo ha alta sensibilità e selettivamente dovuto accurata rilevazione di masse. Applicazione di questo metodo per una vasta gamma di sistemi di nitrosamina-citocromo P450 aiuterà a determinare la generalità di questa trasformazione. Perché citocromo P450s sono polimorfici e variano in attività, una migliore comprensione della formazione di nitrosamide potrebbe aiutare nella valutazione del rischio di cancro individuali.

Introduction

N-nitrosammine sono una vasta classe di agenti cancerogeni trovati nella dieta, prodotti del tabacco e l'ambiente in generale; si possono anche formare in modo endogeno nel corpo umano¹. Più di 300 N -nitroso composti sono stati testati e > 90% sono stati valutati come cancerogeni in modelli animali^2,3. Per esibire la loro cancerogenicità, questi composti devono prima essere attivati dal citocromo P450s^1,2,3. La ricerca dimostra che il citocromo P450s ossidare prontamente nitr....

Protocol

1. materiali e procedure generali

1. Synthesize NNN come precedentemente descritto ¹⁵. Ottenere norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, sistema di rigenerazione NADPH, tampone di reazione 0,5 x e tutte le altre sostanze chimiche o solventi da fonti commerciali in grado reagente.
2. Gli spettri RMN record su uno spettrometro di 500 MHz. Prodotto chimico relazione sposta come parti per milione (ppm). Utilizzare picchi di solventi residui come riferimenti interni per ¹ H-NMR (7,26 ppm CDCl ₃) e ¹³ C-NMR (77,2 ppm CDCl ₃).
   Nota: Peak spaccare usate le seguenti abbreviazioni: s = singolet....

Results

Basato sul lavoro di bianco et al. ¹⁹, norcotinine era nitrosi a NNC in modo pulito e nell'alto rendimento (80-92%) per produrre uno standard per l'esperimento in vitro . Prove strutturali per una reazione di successo è stata ottenuta da analisi spettroscopiche compreso ¹H-NMR, ¹³C-NMR, COSY e HSQC (supporto informazioni) insieme a HRMS che ha confermato la massa di padre [M + H]⁺ all'interno di 5 ppm della valore .......

Discussion

Delucidamento il metabolismo di nitrosammine è un componente critico per comprendere la loro cancerogenicità. Poiché il coinvolto citocromo P450s e altri enzimi metabolici sono polimorfici, ulteriore applicazione di questa conoscenza potrebbe potenzialmente identificare gli individui ad alto rischio^1,4. Nuovi dati indica che l'ulteriore ossidazione di α-hydroxynitrosamines, presunti principali metaboliti di nitrosammine coinvolti nel legame al DNA, a nitrosamides.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Norcotinine	AKoS GmbH (Steinen, Germania)	CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969
Acido acetico	Sigma-Aldrich	695092
Anidride acetica	Sigma-Aldrich	242845
Acetato di ammonio	Sigma-Aldrich	431311
Idrossido di bario	Sigma-Aldrich	433373
D-cloroformio	Sigma-Aldrich	151823
HPLC Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998
Solfato di magnesio	Sigma-Aldrich	M7506
Cloruro di metilene	Sigma-Aldrich	34856
Nitrito di sodio	Sigma-Aldrich	237213
ViVid CYP2A6 Kit di screening blu	Life Technologies	PV6140
Solfato di zinco	Sigma-Aldrich	221376
provette da 0,5 mL	Fisher	AB0533
Pallone a fondo tondo da 100 mL	Sigma-Aldrich	Z510424
Pallone da 125 mL Erlenmeyer	Sigma-Aldrich	CLS4980125
Imbuto separatore da 125 mL	Sigma-Aldrich	Z261017
25 mL rotondo pallone di fondo	Sigma-Aldrich	Z278262
spettrometro NMR 500 MHz	Bruker
Allegra X-22R Centrifuga	Beckman-Coulter
fiale LC	ChromTech	CTC... 0957– BOND
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Scientific
Agitatore magnetico	Sigma-Aldrich	Z127035
Tubo NMR	Sigma-Aldrich	Z274682
pipette P1000, P200 e P10	Eppendorf
Evaporatore rotante	Sigma-Aldrich	Z691410
sistema	RSLCnano UPLCThermo Scientific
Agitazione Bagno d'Acqua	Fisher	FSSWB15
Piastra di Agitazione	Sigma-Aldrich	CLS6795420
PicoFrit	Colonna Nuovo Obiettivo	PF3607515N5
Luna C18, 5 um	Phenomenex	535913-1