Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden
Summary
Este estudio divulga a dos diferentes métodos para el análisis de invasión celular y la migración: el análisis de la cámara de Boyden y en vitro video microscopio basado cicatrización ensayo. Los protocolos de estos dos experimentos se describen y se comparan con sus beneficios y desventajas.
Abstract
La capacidad de invasión y migración de las células tumorales es principales contribuyentes a la recidiva y progresión del cáncer. Muchos estudios han explorado las migración y la invasión habilidades para comprender cómo difusión las células cancerosas, con el objetivo de desarrollar nuevas estrategias de tratamiento. Análisis de las bases celulares y moleculares de estas habilidades ha conducido a la caracterización de la movilidad celular y las propiedades fisicoquímicas del citoesqueleto y del microambiente celular. Durante muchos años, el análisis de la cámara de Boyden y el ensayo de rayado de la herida han sido las técnicas estándar para el estudio de la migración e invasión celular. Sin embargo, estas dos técnicas tienen limitaciones. El ensayo de cámara de Boyden es difícil y desperdiciador de tiempo, y el ensayo de rayado herida tiene baja reproducibilidad. Desarrollo de tecnologías modernas, especialmente en la microscopia, ha incrementado la reproducibilidad de la prueba de scratch de la herida. Uso de sistemas de análisis de gran alcance, un microscopio de vídeo “en la incubadora” puede utilizarse para proporcionar análisis automático y en tiempo real de la migración celular y la invasión. El objetivo de este trabajo es informar y comparar los dos análisis utilizados para el estudio de invasión celular y la migración: el análisis de la cámara de Boyden y un optimizado en vitro video microscopio base cero herida ensayo.
Introduction
Migración y la invasión de células participan en la diseminación de células cancerosas, que es la principal causa de resistencia a los tratamiento1 y pueden llevar a locorregional o metastásica recurrencia después de tratamiento del cáncer2. La transición epitelial-mesenquimal (EMT) es el proceso inicial de invasión-migración de la célula en que el cáncer de las células cambia de un epitelio a un fenotipo mesenquimal. E-cadherina es un marcador extracelular del fenotipo epitelial3y aumento de la expresión de N-cadherina y vimentina es característica del fenotipo mesenquimal4. La migración también depende de la capacidad intrínseca de las células cancerosas invaden la matriz extracelular (ECM) a través de la acción de metaloproteasas de matriz5.
Este mecanismo de invasión, la migración se ha descrito para el cáncer en muchos lugares, particularmente en cáncer de cabeza y cuello6. Muchos investigadores se han centrado en los procesos de migración y la invasión para entender mejor cómo las células cancerosas se difusión en la esperanza de que este conocimiento conducirá a nuevas estrategias de tratamiento. Es crucial que estos estudios se realizan utilizando ensayos fiables y reproducibles.
Análisis in vitro de motilidad de la célula pueden ser difícil. Desarrollada hace muchos años, el análisis de la cámara de Boyden se considera para ser el estándar para la invasión – migración análisis7. Sin embargo, es lento y a menudo es inexacta. Una segunda prueba es la cicatrización ensayo8, que implica hacer un rasguño en un cultivo celular de monocapa y captura de imágenes de invasión celular y la migración a intervalos de tiempo fijo. Esta técnica ha sido ampliamente criticada debido a las grandes variaciones entre los resultados de dos pruebas sucesivas. Sin embargo, la aplicación de tecnologías modernas, especialmente en microscopia, ha mejorado la reproducibilidad de la prueba de scratch de la herida. Videos microscopios pueden introducirse fácilmente en incubadoras y pueden generar imágenes en tiempo real de la migración de la célula. Estos dispositivos registran datos microscópicos y proporcionan un análisis automático de confluencia celular de herida con el tiempo. El objetivo de este trabajo es describir el ensayo de cámara de Boyden y el herida rasguño optimizado el análisis y discutir las ventajas y debilidades de cada enfoque.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí divulgamos dos modalidades diferentes para estudiar el proceso de invasión y migración celular. El análisis de este proceso es importante para comprender los factores que intervienen en la recurrencia metastásica, que podría explicarse por aumento de la movilidad de una subpoblación de células de cáncer llamado cáncer células madre10,11.
El experimento de la cámara de Boyden es uno lo más frecuentemente usado técnica…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estas técnicas fueron desarrolladas con el apoyo de la empresa LabEx PRIMES (ANR-11-LABX-0063), el Contrat Plan-estado-región (CPER) en el marco científico de ETOILE (CPER 2009-2013) y lírica Grant INCa-DGOS-4664.
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
Riferimenti
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