Bewertung der Zelle Invasion und Migration-Prozess: ein Vergleich des Video Mikroskop-basierte Kratzers Wunde Assay und der Boyden Kammer-Test
Summary
Diese Studie berichtet zwei verschiedene Methoden für die Analyse der Zelle Invasion und Migration: Boyden Kammer Assay und der in-vitro- video Mikroskop-basierte Wundheilung Assay. Die Protokolle für diese zwei Experimente werden beschrieben und ihre Vorteile und Nachteile gegenüber.
Abstract
Die Invasion und Migration Fähigkeiten von Tumorzellen sind Hauptursachen für Krebs Fortschreiten und Wiederkehr. Viele Studien haben untersucht, die Migration und Invasion Fähigkeiten zu verstehen, wie Krebszellen zu verbreiten, mit dem Ziel neue Behandlungsstrategien zu entwickeln. Analyse der zellulären und molekularen Grundlagen dieser Fähigkeiten führte zu der Charakterisierung der Zelle Mobilität und die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Zytoskeletts und zelluläre Mikroumgebung. Seit vielen Jahren haben der Boyden Kammer Assay und der Kratzer Wunde Assay die Standardtechniken Zellinvasion und Migration zu studieren. Beide Techniken haben jedoch Einschränkungen. Boyden Kammer Assay ist schwierig und zeitaufwendig, und Kratzer Wunde Assay hat niedrige Reproduzierbarkeit. Entwicklung moderner Technologien, vor allem in der Mikroskopie ist die Reproduzierbarkeit des Scratch Wunde Assays gestiegen. Verwenden leistungsstarke Analyse-Systeme, ein “Inkubator” Videomikroskop lässt sich automatisch und in Echtzeit Analyse der Zelle Migration und Invasion. Das Ziel dieses Papiers ist, zu berichten und vergleichen die beiden Assays verwendet, um Zelle Invasion und Migration zu untersuchen: Boyden Kammer Assay und eine optimierte in-vitro- video Mikroskop-basierte Scratch Wunde Assay.
Introduction
Zellinvasion und Migration sind die Verbreitung von Krebszellen, die die Hauptursache der Widerstand gegen die Behandlung1 ist beteiligt und können zu locoregionaler oder metastasierten Rezidiv nach Krebs Behandlung2führen. Die epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) ist der erste Prozess der Invasion-Zellwanderung in welcher Krebs Zellen mesenchymalen Phänotyp aus einer epithelialen wechseln. E-Cadherin ist eine extrazelluläre Marker der epithelialen Phänotyps3und erhöhte Expression von N-Cadherin und Vimentin ist charakteristisch für die mesenchymalen Phänotyp4. Migration hängt auch von der Fähigkeit von Krebszellen, die extrazelluläre Matrix (ECM) zu erobern durch das Wirken des Matrix-Metalloproteasen-5.
Diese Invasion – Migration-Mechanismus wurde für Krebs an vielen Orten, vor allem im Kopf-Hals-Krebs-6beschrieben. Viele Forscher konzentrierten sich auf die Migration und Invasion Prozesse besser zu verstehen, wie Krebszellen in der Hoffnung zu verbreiten, die dieses Wissen zu neuen Behandlungsstrategien führen wird. Es ist wichtig, dass diese Studien mit zuverlässige und reproduzierbare Tests durchgeführt werden.
In-vitro- Analyse der Zelle Motilität kann schwierig sein. Vor vielen Jahren entwickelte der Boyden Kammer-Test gilt der Standard für Invasion – Migration Analyse7. Aber es kostet Zeit und ist oft ungenau. Ein zweiter Test ist die Wundheilung Assay8, beinhaltet einen Kratzer auf einer Zellkultur Monolage und Aufnahmen der Zelle Invasion und Migration in festen Zeitabständen. Diese Technik ist weithin wegen der großen Schwankungen zwischen den Ergebnissen von zwei aufeinanderfolgenden Tests kritisiert worden. Allerdings hat die Anwendung moderner Technologien, vor allem in der Mikroskopie, die Reproduzierbarkeit des Scratch Wunde Tests verbessert. Video-Mikroskope können leicht in Inkubatoren eingeführt werden und können in Echtzeit Bilder von Zellwanderung erzeugen. Diese Geräte zeichnen mikroskopische Daten und bieten automatische Analyse der Wunde Zelle Zusammenfluss im Laufe der Zeit. Das Ziel dieses Papiers ist Boyden Kammer Assay und optimierte Scratch Wunde Assay zu beschreiben und um die Vorteile und Schwächen der einzelnen Ansätze zu diskutieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir berichten hier zwei verschiedene Modalitäten Zellprozess Invasion und Migration zu studieren. Die Analyse dieses Prozesses ist wichtig für das Verständnis der Faktoren bei metastasierendem Wiederholung, die durch erhöhte Motilität der eine Subpopulation von Krebszellen, die sogenannten Krebs-Stammzellen10,11erklärt werden könnte.
Boyden Kammer Experiment ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken, erkunden Zell-Invasi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Techniken wurden mit der Unterstützung von LabEx Primzahlen (ANR-11-LABX-0063), Contrat Plan-Etat-Region (CPER) im wissenschaftlichen Rahmen des ETOILE (CPER 2009-2013) und lyrische Grant Inka-DGOS-4664 entwickelt.
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
Riferimenti
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