Disección y preparación del segmento Coronal de desarrollo de hipófisis de ratón
Summary
Presentamos un protocolo para diseccionar las glándulas pituitaria y preparar pituitarias secciones coronales de desarrollar ratones.
Abstract
La glándula pituitaria o hipófisis es un importante órgano endocrino que secreta hormonas esenciales para la homeostasis. Consta de dos glándulas con funciones y orígenes embrionarios separados, la neurohipófisis y la adenohipófisis. La hipófisis de ratón en desarrollo es pequeño y delicado con una forma oval alargada. Una sección coronal es preferida para mostrar la adenohipófisis y la neurohipófisis en una sola rebanada de la hipófisis de ratón.
El objetivo de este protocolo es lograr la correcta secciones coronales pituitarias con arquitecturas de tejido preservado de desarrollar ratones. En este protocolo, se describe en detalle cómo diseccionar y glándulas pituitarias correctamente de desarrollar ratones. En primer lugar, ratones son fijados por perfusión de transcardial del formaldehído antes de la disección. Luego se aplican tres diferentes técnicas de disección para obtener las glándulas pituitaria intactas dependiendo de la edad de los ratones. Para ratones fetales a partir de 17.5-18.5 días embrionarios (E) y los recién nacidos hasta 4 días, las regiones de sella todo incluyendo el hueso esfenoides, glándulas y nervios de trigeminal se disecan. Para cachorros edad postnatales días (P) 5-14, las glándulas pituitaria conectados con los nervios de trigeminal son disecados en su conjunto. Para ratones de 3 semanas de edad, las glándulas pituitarias se disecan con cuidado gratis de los tejidos circundantes. También nos muestra cómo incrustar las glándulas pituitarias en una orientación adecuada mediante el uso de los tejidos circundantes como puntos de referencia para obtener satisfacción de secciones coronales. Estos métodos son útiles en el análisis de características histológicas y del desarrollo de las glándulas de la hipófisis en el desarrollo de ratones.
Introduction
La glándula pituitaria o hipófisis es un importante órgano endocrino que secreta hormonas esenciales para la homeostasis1,2. Anatómicamente, la glándula pituitaria es una estructura de ” dos en uno ” que consiste en la neurohipófisis y la adenohipófisis. Estas piezas tienen función y diferente origen embrionario muy diferentemente. La neurohipófisis deriva del ectodermo neural y segrega oxitocina y hormona antidiurética. La adenohipófisis se origina de la bolsa de Rathke y es responsable de la liberación de hormonas, incluyendo hormona del crecimiento, prolactina, tirotropina, hormona folículo estimulante, hormona luteinizante, hormona adrenocorticotrópica, y hormona estimulante de melanocitos3,4,5.
La glándula pituitaria se basa en la superficie dorsal del hueso esfenoides (silla turca) del cráneo de ratón y se une a la planta del cerebro por un tallo frágil. Lateralmente está rodeado por los nervios trigémino y anterior por el quiasma óptico6,7. La glándula tiene una forma oval alargada con su eje perpendicular a la de la cabeza. En su superficie dorsal, la neurohipófisis y la adenohipófisis pueden fácilmente ser demarcadas, con el anterior ocupando la región medial dorsal y extender este último lateral y ventralmente. Durante el desarrollo postnatal, el tamaño de la hipófisis aumenta rápidamente en el primer mes después de nacimiento8,9. Sin embargo, la hipófisis de ratón todavía es muy pequeña en tamaño con un peso promedio de 1,9 mg y un diámetro de eje largo de ~ 3 mm en adultos10, un diámetro de eje largo de 2-2.5 mm en el día postnatal 21 (P21) y sólo 1-1.5 mm en P0.
Una sección coronal es preferida para mostrar en una sola rebanada de la hipófisis de ratón la adenohipófisis y neurohipófisis. Sin embargo, algunas habilidades técnicas se requieren para obtener satisfacción de secciones coronales de glándulas pituitarias de desarrollar ratones debido a su tamaño excepcionalmente pequeño y la distinta anatomía. En este artículo de vídeo, nos muestran cómo diseccionar glándulas pituitarias de ratón y preparar las secciones coronales pituitarias en diversas etapas del desarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para el desarrollo de pituitaries murinos, ha sido técnicamente difícil de obtener secciones coronales adecuadas debido a su diminutas y frágil características y características anatómicas únicas6,8. Algunos grupos de investigación así eligieron secciones sagital para analizar la morfología embrionaria y neonatal pituitaria11,12. Aunque la sección sagital de la hipófisis también es capaz de m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las becas de la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (31201086, 31470759 y 31671219) y la Fundación de Ciencias naturales de Shanghai (12ZR1436900).
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
Riferimenti
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