Summary
Vi beskriver puff teknikken, som farmakologisk reagenser kan administreres under hele celle patch-klemme opptak, og fremheve ulike sider av funksjonene som er avgjørende for suksessen.
Abstract
Farmakologiske administrasjon brukes vanligvis når du utfører hele celle patch-klemme i hjernen skiver. En av de beste metodene for medikament programmet elektrofysiologiske innspillingen er puff teknikken, som kan brukes til å studere effekten av farmakologiske reagenser på neuronal aktiviteter i hjernen skiver. Den største fordelen med puff programmet er at stoffet konsentrasjonen rundt innspillingen området øker raskt, dermed hindre foreskrevet membran reseptorer. Vellykket bruk av puff søknad innebærer oppmerksomheten følgende elementer: konsentrasjonen av stoffet, parameterne for puff brønnene, avstanden mellom spissen av puff brønnene og Nevron registrert og varighet og Trykk kjøring puff (pounds per kvadrattomme, psi). Denne artikkelen beskriver en trinnvis fremgangsmåte for opptak hele celle strøm av damper gamma - aminobutyric acid (GABA) på en Nevron en prefrontal kortikale sektoren. Spesielt kan den samme fremgangsmåten brukes med mindre modifikasjoner til andre hjernen områder som hippocampus og striatum og forskjellige preparater, som cellekulturer.
Introduction
Patch-klemme teknikken, hovedverktøy for å undersøke elektriske signaler i neurons, ble utviklet på 1970-tallet1,2. En stor fordel av denne teknikken er at den gir kunnskap om hvordan bestemte behandlinger (f.eks farmakologiske) kan endre neuronal funksjoner eller kanaler i sanntid3. Farmakologiske evaluering av neuronal funksjonen under hele celler i et hjernen stykke krever at programmet av stoffer som agonister eller antagonister av spesifikke reseptorer, neurons registreres. Denne metoden tillater identifikasjonen nevronale endringer som oppstår etter bruk av et bestemt legemiddel, dermed fører til en bedre forståelse av fysiologiske og patologiske egenskapene av neurons4. Selv om farmakologiske administrasjon kan utføres via enten perfusjon5 eller blåse6, er sistnevnte overlegen teknikken. Spesielt: (i) puff søknad raskt øker narkotika konsentrasjon rundt innspilte Nevron til et nivå slik at desensitization av membran reseptorer deaktiveres; (ii) volumet av narkotika andpusten er ekstremt lav, slik at det er liten effekt på bad løsningen, noe som dermed reduserer eventuelle uønskede effekter av administrert kjemikaliene på hjernen skiver; (iii) puff protokollen kan være satt og lagret, gjør eksperimentet meget presist reproduserbar; (iv) puff søknad representerer økonomisk bruk av agonister/antagonister, spesielt hvor slike reagenser er dyrere eller vanskeligere å få.
Her vil vi fokusere på opptak hele celle strøm av damper GABA i akutt forberedt hjernen skiver, et preparat som har fordelen av relativt godt bevart hjernen kretser. Hvordan vi utfører puff-indusert hemmende strøm7 vil bli beskrevet i denne artikkelen. Ved hjelp av cesium (Cs+)-baserte intern løsninger og holde neurons 0 mV, vil vi presentere GABA blåse utløste hemmende postsynaptic strøm (eIPSCs) med passende tekniske detaljer. Bruke en musemodell av depresjon indusert av lipopolysakkarid (LPS) injeksjon8, vi viser at eIPSC er amplitude fremkalt av en GABA puff betydelig redusert i skiver av LPS-injisert mus forhold til bilen kontroller. Vår intensjon er at denne artikkelen skal vise hvordan puff teknikken er vidt gjelder studier vurdere effekten av kjemikalier, stoffer eller medikamenter på neuronal aktiviteter i hjernen skiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr boliger og alle dyr forsøk ble gjennomført i henhold til prosedyrene som er godkjent av den etiske komiteen for dyr forskning på Sør pedagogiske universitet, i henhold til retningslinjene for Animal Care etablert av National Institute of Helse.
1. forberedelse av løsninger
- forberede 500 mL standard kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) inneholder komponenter som beskrevet i våre publisert arbeid 7 som er oppført i tabell 1.
- Bruk ren glass kanner med deionisert vann å utarbeide en fersk ACSF løsning. Rene spatler med deionisert vann og tørr før du bruker legge NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4 D-glukose, og legge til CaCl 2 etter å ha boblet løsningen med 95% O 2 / 5% CO 2 blandingen for ~ 20 min (som beskrevet i tabell 1) til 500 mL deionisert vann. Rør til fullt ut oppløst.
- Kontrollerer ACSF er helt klart uten noen nedbør. Juster deretter pH 7.2-7,4. Boble med en gassblanding består av 95% O 2 og 5% CO 2 for ~ 20 min.
- Forberede 250 mL skive kutte løsning som inneholder kjemikalier 7 beskrevet i tabell 2.
- Legge til KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glukose og legge CaCl 2 siste som angitt i 1.1.1, til 250 mL deionisert vann og oppløse som beskrevet i 1.1.1 og 1.1.2.
- Etter bobler med 95% O 2 / 5% CO 2, plasserer løsningen i en fryser i 15-20 min slik at kutte løsningen blir iskald og delvis frosne.
Merk: Vi bruker kutte løsningen når stykker fra 1-2-måneden-gamle mus; Formelen kan variere for mus eldre enn 2 måneder. - Forberede LPS løsning smelte i sterilt endotoxin-fri isotonic saltvann (0,9% NaCl). LPS er administrert intraperitoneally (0,5 mg/kg) og registrere 2t senere.
2. Utarbeidelse av Prefrontal Cortex stykke
- tar kutte løsningen ut av fryseren og homogenize for å få en slaps. Plasser løsningen på is og boble stadig med 95% O 2 / 5% CO 2.
- Med stor, skarp saks, raskt halshugge mus som beskrevet 9 og umiddelbart legge hodet i et beaker fylt med iskald (0-4 ° C) kutte løsning.
- Skjær toppen av skallen langs midtlinjen caudal til nasal retning med fine saks og fjern den laterale skalle delen. Fjerne hjernen med en fin spatel og slipp i iskalde kutte løsning.
Merk: Trinn 2.2-2.3 må gjøres raskt (ideelt < 1 min). - Setter hjernen på lokket på en 9 cm Petriskål fylt med is. Skyll hjernen med iskald kutte løsning. Kuttet lillehjernen og olfactory pære med et barberblad.
- Bruk cyanoacrylate lim til prøven innehaver av en vibratome. Forsiktig plassere hjernen blokken på dråpe lim, rostral side opp, og umiddelbart oppsluke iskald kutte løsning.
- Juster bladholderen av vibratome til en vinkel på 15° med horisontalplanet og forberede 350-µm koronale hjernen skiver (bladet vibrasjonsfrekvens = 85 Hz, hastighet = 0,1 mm/s).
- Bruker en pipette, overføring skiver inn i gjenvinning kammeret fylt med ACSF, ruge 1t (på RT) med konstant boblende 95% O 2 / 5% CO 2.
3. Hele celle Patch innspillingen
- gjør glass borosilicate Mikropipetter for bruk som opptak elektrodene eller puff Mikropipetter etter bestemte retningslinjer i bruksanvisningen avtrekker. Opptak elektroder, tips motstand er i området 4-6 M Ω, mens puff Mikropipetter har tips diameter i området 2-5 µm.
- Legge til Na + kanal blokker (TTX, 1 µM), blokk rask Na + kanal og dermed handling potensial, til ACSF og opprettholde en konstant flow rate av denne løsningen på 2-3 mL/min i innspillingen kammeret, av peristaltiske pumpen i kammeret og aspirasjon av den. Boble ACSF med 95% O 2 / 5% CO 2 stadig å sikre levedyktigheten til skiver.
- Overføre et hjernen stykke inn i innspillingen kammeret ved hjelp av en modifisert Pasteur pipette som fine tips ble kuttet utsnittet skive. Dekke stykket med en platina skive anker med parallell nylontråder linjeavstand ≥ 2 mm fra hverandre å holde sektoren på plattformen.
- Fylle opptak brønnene med intern løsning 7 (tabell 3), og fylle puff Mikropipetter med GABA 10 µM, 50 µM, og 100 µM (oppløst i ACSF) eller ACSF som kjøretøy kontroll.
- å hindre blokkering med rusk, bruke lett positive trykk ved hjelp av en 1 mL sprøyte før fordyper opptak elektroden i ACSF. Med en micromanipulator under et mikroskop (4 x linsen), plassere opptaket elektrode og puff brønnene slik at tipsene vises i midten av skjermen ( figur 1 A) video bildet.
- Justere mikroskop fokus (40 x linsen) mens du gradvis redusere puff brønnene og plasser den over opptak Nevron i en vinkel på 45°. Beholde avstanden mellom spissen av puff brønnene og Nevron registrert mellom 20-40 µm ( figur 1 B). Sakte og forsiktig tilnærming Nevron med innspillingen elektroden og slipper det positivt trykket. Bruke en svak og kort sugekraft gjennom slangen koblet til den elektrodeholderen giga ohm vakuumproduksjon.
- Behold spenningsnivået 0 mV. Etter dannelsen av giga ohm segl, kompensere for rask og treg kapasitans manuelt eller automatisk. Bruk deretter en kort og sterk sugekraft gjennom slangen nevnt ovenfor for å komme inn hele cellemodus.
- Posten eIPSC i spenning-klemme modus. Lav gasstrykket (nitrogen, 4-6 psi) gjelder puff brønnene bruke et Picospritzer styrt av en Master 8 spenning trinn generator for å levere enkle eller sammenkoblede GABA puffs ( figur 2).
- Endre puff varigheten for å oppnå best eIPSC resultat ( Figur 3) og måle eIPSC i LPS-innsette nedgangstiden modellen ( Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Puff teknikken kan forskere studere effekten av legemidler på bestemt reseptorer på overflaten av en gitt Nevron. I denne artikkelen fokusere vi på strøm formidlet av GABA reseptorer. Figur 1 viser Mikropipetter puff og opptak. Eliminere noen effekt på innspilte nevroner i fysiske presset generert av puff, ACSF og sukrose puffs (figur 2A) brukes som kontroller. Svaret indusert av en GABA puff (svart) kan bli blokkert av en GABA-reseptor hemmere, som picrotoxin som rapportert10, mens den opprinnelige tilstanden kan utvinnes av ACSF vaske-out (blå), som vist i figur 2B. Spesielt induserer en ACSF verken en sukrose puff en respons, antyder at svar av GABA puffs fysiologiske og er formidlet av GABA reseptorer på overflaten av innspilte cellen. Dose og puff varighet svar kurvene er vist i Figur 3.
LP-plater har vist seg å endre neuronal aktiviteter og dyr atferd, men dens effekt på GABA reseptor-mediert svar var ikke godt kjent. Når vi sammenligner strøm indusert av GABA puffs i hjernen skiver av LPS-injisert og kjøretøy kontroll mus, observerer vi reduserte IPSC amplituder på grunn av LPS behandling (Figur 4).
Figur 1 . Diagram over puff brønnene og opptak elektroden.
(A) avstanden mellom vindpust og opptak Mikropipetter. (B) puff brønnene (venstre) og opptak elektroden (høyre) på overflaten av en hjerne skive. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Picrotoxin blokade av IPSC indusert av GABA puff.
(A) Puffing ACSF og sukrose (50 µM) medfører ingen respons. (B) Puffing 50 µM GABA induserer en IPSC (svart) (puff varighet = 200 ms, 4-6 psi) i ACSF som inneholder TTX (1 µM), CNQX (20 µM) og AP5 (50 µM) å blokkere handling potensialer og eksitatoriske gjeldende formidlet av AMPA og NMDA reseptorer. GABA-indusert IPSC blokkeres ved bad en GABA receptor inhibitor, 100 µM picrotoxin (rød). IPSC gjenoppretter etter vask ut av picrotoxin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Dose og puff varighet svar kurver.
(A) prøve IPSCs av 10, 50 og 100 µM GABA (puff varighet = 50 ms, 4-6 psi). (B) Puff varighet svar kurver. Svart, n = 11; rød, n = 8; blå, n = 10; polynom passer. Dataene vises som av flere eksperimenter (8 ≤ n ≤11); feilfelt viser SEM. (C) repeterende strøm fremkalt av GABA (50 µM) puffs i mellom vindpust intervaller på 1, 2 eller 3 s (puff varighet = 100 ms, 4-6 psi). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . eIPSC amplitude reduseres i LPS-injisert mus forhold til bilen kontroller.
Damper GABA induserer en betydelig redusert IPSC amplituden i LPS-injisert vs kontroll neurons (saltvann, 19.74 ± 1.93 pA/pF; LP-plater, 14.10 ± 1.30 pA/pF; p = 0,02). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Stoff | g/mol | Konsentrasjon (mM) | Vekt (finans) |
| NaCl | 58.443 | 119 | 6.9547 |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1 | 0.1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26.2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0.1565 |
| D-glukose | 198.17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110.98 | 2.5 | 0.2775 |
Tabell 1. Opptak ACSF.
| Stoff | g/mol | Konsentrasjon (mM) | Vekt (finans) |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0.6665 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Choline· CL | 139.63 | 115 | 16.0575 |
| D-glukose | 198.17 | 7 | 1.3872 |
| CaCl2 | 110.98 | 0,5 | 0.0555 |
Tabell 2. Skjær kutte løsning.
| Stoff | g/mol | Konsentrasjon (mM) | Vekt (finans) |
| CS gluconate | 328.052 | 100 | 32.8052 |
| CsCl | 168.36 | 5 | 0.8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2.3830 |
| MgCl2 | 95.211 | 2 | 0.1904 |
| CaCl2 | 110.98 | 1 | 0.1110 |
| BAPTA | 476.43 |
Tabell 3. Intern løsning for hele celle oppdateringen innspillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Puff søknad er mye brukt til å evaluere postsynaptic reseptor funksjonen3,4,7, men krever presis kontroll hvert eksperiment. Her beskriver vi en prosedyre som involverer hele celle oppdateringen clamping, som viser GABA blåse indusert IPSCs (dvs. eIPSCs) i prefrontal kortikale hjernen skiver. Motstanden av opptak elektroden er ca 5 MΩ, mens tuppens diameter av puff Mikropipetter handler om 2-5 µm. Puff trykket mellom 4-6 psi: dette området er kritisk, høyere trykk kan forårsake neuronal skade, mens lavere trykk kan medføre utilstrekkelig aktivering av postsynaptic GABA reseptorer. Den vannrette avstanden fra spissen av puff brønnene til Nevron registrert er omtrent 20-40 µm (diameter på 1-2 nerveceller) og vinkelen mellom vindpust brønnene og skive overflaten er ca 45°. Spissen av puff brønnene er loddrett 20-40 µm over sektoren (z-akse). Hele puff bør være i området 10-150 ms. henhold til ovennevnte hensyn, puffs 10-50 µM GABA indusere en hensiktsmessig nevrale respons og eIPSC amplitude og kinetisk parametere innhentet er reproduserbare. Selv om protokollen beskrevet her fokuserer på puff søknad å en skive patch, er det også passer til opptak i neuronal kulturer, som vist i våre publisert arbeid7.
Vi viser også her eIPSCs skyldes sammen blåse anvendelse av GABA. Sammen-puls protokoller brukt mye til å evaluere presynaptic egenskaper7,11, men mulig postsynaptic effekter, for eksempel endringer i nevrotransmitter-reseptor forpliktende rate og forpliktende tilhørighet, som kan påvirke sammen-puls prosenter, ikke kan bestemmes ved presynaptic sammen-puls stimulering. Protokollen beskrevet i denne artikkelen gir en måte å belyse postsynaptic endringer i respons på parede og selv puls-tog stimuli. Reduksjon i eIPSC amplituden i prefrontal cortex av LPS-injisert mus antyder at endrede nivåer eller aktivitet av GABA reseptorer kan grunn LPS-indusert atferdsendringer.
Men, som med de fleste stoffet levering teknikker, er det vanskelig å vite nøyaktig GABA konsentrasjonen nådde målet cellen, er det fortsatt mulig å opprettholde konsentrasjonen av GABA på visse nivåer i vev ved å være i samsvar med typen Mikropipetter brukes, og med parametere slik som puff stasjonen trykk og avstand. I vårt tilfelle er volumet av løsning andpusten om 1.1 µL på 100 ms varighet. Dermed kan damper kvantitative studier skal utføres7,12.
Utarbeidelse av sunn hjernens skiver fra akutt prefrontal cortex er avgjørende for puff registrering prosedyre beskriver vi, og følgende punkter skal bæres i bakhodet. Først analysere hjernen og skille prefrontal cortex raskt (< 1 min) og deretter holde hjernen blokken i iskalde kutte løsning for mer enn 1 min. Deretter Lim tett hjernen blokken på prøveholderen av vibratome, eller ellers hjernen blokken kan flyte under snitting. Hastigheten og hyppigheten av vibratome bør settes til å generere selv sunn skiver. Anstrengelser må gjøres å gjennomføre alle over prosedyrer på 0-4 ° C å minimere neuronal excitability.
Det er verdt å merke seg at kutte løsningen vi beskriver i denne artikkelen skal brukes for 1-2 måneden-gamle mus. For eldre mus (dvs. > 3 måneder), kutte løsningen bør byttes som beskrevet13. Puff teknikken gjelder for en rekke patch-klemme forsøk med farmakologiske behandlinger, og kan også brukes til å teste effekten av legemidler på den elektriske aktiviteten av alle neurons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne gjerne takke følgende organisasjoner: National Natural Science Foundation i Kina (31171018, 31171355), vitenskap og teknologi divisjon i Guangdong (2013KJCX0054), Natural Science Foundation av Guangdongprovinsen ( 2014A030313418, 2014A030313440), og Guangzhou vitenskap og teknologi Bureau (201607010320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
- Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33 (2012).
- Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
- Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
- Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
- Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
- Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
- Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
- Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
- Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).
