풀링된 shRNA MeCP2 재 활성화 비활성화 X 염색체에 대 한 화면
Summary
우리 보고 작은 헤어핀 RNA (shRNA) 반딧불 luciferase murine 셀 라인에서 x 염색체 비활성화의 레 귤 레이 터를 식별 하기 위한 다음 세대 시퀀싱 기반 프로토콜 및 hygromycin 저항 유전자는 메 틸 CpG 바인딩 단백질 2 (융합 MeCP2) 비활동 성 X 염색체에 유전자입니다.
Abstract
리포터 유전자는 섬으로에 삽입을 사용 하 여 앞으로 유전 스크린 모델 생물에서 후 컨트롤의 메커니즘을 조사를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 짧은 머리 핀 RNAs (shRNAs) 및 클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR)를 포함 하 여 기술 2 중 포유류 세포에서 이러한 화면을 활성화 했습니다. 여기 우리 x 염색체 비활성화 (XCI)의 레 귤 레이 터에 대 한 대규모 shRNA 스크린 반딧불 luciferase murine 셀 라인을 사용 하 여 설명과 hygromycin 저항 유전자에서 절 메 틸 CpG 의무적인 단백질의 C-말단에 2 (MeCP2) 유전자 에 비활성 x 염색체 (Xi). 기자 셀 라인 구축의 재 활성화 hygromycin B 선택, 큰 shRNA 라이브러리 및 그들의 포스트 선택 농축을 사용 하 여 측정 하 여 기자를 다시 활성화 하는 헤어핀을 식별를 생존 우위를 수 여 다음-세대 시퀀싱입니다. 풍부한 헤어핀은 개별적으로 xi luciferase 기자를 활성화 하는 능력을 테스트 하 여 확인 됩니다.
Introduction
한 여성, 레트 증후군, 유전 성 정신 장애의 가장 일반적인 형태는 MeCP2, 정상적인 신경 기능1에 필수적인 단백질을 인코딩하는 x 염색체 유전자 heterozygous 돌연변이 의해 발생 합니다. 이 장애를 치료 하는 잠재적인 접근 방식을 것 사이에 야생-타입 MeCP2 대립 유전자의 재 활성화 MeCP2 식의 유신이 질병1, 의 마우스 모델에서 신경학 상 적자를 표시 했다 2 , 그러나 4., 단단히는 유기 체3,4의 수명에 걸쳐 유지 한 개의 암 세포에서 염색체 X의 epigenetic 입을 하 고 사이 유전자의 강력한 재 활성화 가능성이 주요 요구 여러 epigenetic 규제 경로의 교란 한다입니다.
MeCP2 침묵의 유지 보수에 필요한 요소를 식별 하려면 우리가 먼저 개발 유전자 변형 마우스 두 X 염색체 중 하나에 MeCP2-luciferase-hygromycin 저항 유전자 융합 (MeCP2-뤽-시간)을 들고 (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. 비록 MeCP2 퓨전 구문에서 표현 된이 불안정 하 고 손실 함수, hemizygous 남성 (MeCP2 뤽 시간/Y) X에 MeCP2 삭제 phenotypically 흉내 낸 리포터 유전자의 표현에에서 결과 판명 내 생 MeCP25의 식과 일치 패턴에서 쉽게 감지 했다. 우리 다음 비활성 또는 액티브 x 염색체에 구조와 불멸 하 게 섬유 아 세포 클론을 생성 하 고 그 전 표현 야생 타입 MeCP2 하지 기자 구문; 확인 역은 후자에 대 한 사실 이다. DNA 유전자 침묵, 파기를 알려진 에이전트 demethylating 5-azacytidine (5-아 자)에 노출 되 면 셀 (“기자 셀”) 사이에 기자와 얻은 활동 우리의 구문을 다시 활성화 수 나타내는 생물 발광 분석 결과에 따라서 유전자 검사에 대 한 사용.
우리는 다음 MeCP2 침묵의 레 귤 레이 터에 대 한 높은 처리량 유전 스크린을 개발 했다. 기자 셀 라인 처음 retroviral 라이브러리를 포함 하는 감염 > 60000 다른 shRNAs 대상 > 마우스 게놈5,6, 걸쳐 25000 유전자 다음 hygromycin B 선택 대상. 헤어핀 주파수 사전에 비교 했다 고 후 선택 샘플 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여, 기자로 재 hygromycin B 선택 성장 이점 수 여 책임 헤어핀의 풍부 귀착되 었 다. 이 방식을 사용 하 여, 우리는 MeCP2 , 침묵에 연루 30 유전자를 확인 하 고 이후 개별 헤어핀 기자 셀 시험 그들의 luciferase 활동을 측정 하 여 결과 확인.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 최근 연구6, luciferase murine 셀 라인 생성 그리고 hygromycin 저항 유전자는 사이에 MeCP2 융합의 도서관으로 불리고 > 60000 shRNAs 대상 > 25000 유전자. 우리는 발견 30 유전자 hygromycin B 선택, 누구의 노크 다운 수 여 생존 이점을 MeCP2 x 염색체 입을 통제에서 그들의 역할을 제안. 이러한 결과 개별 헤어핀으로 보고 셀 라인을 시험 하 고 침묵 luciferase 기자의 재 활성화를 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기꺼이 shRNA 라이브러리 화면에서 사용을 제공 하기 위한 멜버른의 대학 로스 Dickins 감사 합니다. 이 작품으로는 레트 증후군 연구 신뢰 (A.B.) 투자 되었다.
Materials
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
Riferimenti
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