ShARN regroupée écran pour la réactivation de MeCP2 sur le Chromosome X inactif
Summary
Nous rapportons une petite épingle à cheveux RNA (shARN) et le protocole axée sur le séquençage de prochaine génération pour identifier les responsables de la réglementation de l’inactivation du chromosome x dans une lignée de cellules murines avec luciférase firefly et gènes de résistance à l’hygromycine fusionnée à la méthyl CpG binding protein 2 ((en anglais seulement) MeCP2) gène sur le chromosome X inactif.
Abstract
Avancer les écrans génétiques à l’aide de gènes rapporteurs insérées dans l’hétérochromatine ont été largement utilisés pour étudier les mécanismes de contrôle épigénétique dans organismes modèles. Technologies, y compris les ARN en épingle à cheveux courts (interférents) et cluster régulièrement dois‑je répétitions courtes palindromiques (CRISPR) ont permis à ces écrans dans des cellules de mammifères diploïdes. Nous décrivons ici un écran de shARN à grande échelle pour les régulateurs de l’inactivation de chromosome x (XCI), avec une lignée de cellules murines luciférase de firefly et de gènes de résistance à l’hygromycine frappa dans à l’extrémité C-terminale de la protéine liant le CpG de méthyle 2 gène (MeCP2) sur le chromosome de x inactif (Xi). Réactivation de la construction dans la lignée de cellules de journaliste conféré un avantage en survie sous sélection hygromycine B, nous permettant de cribler une banque de shARN grand et identifier les piques qui a réactivé le reporter en mesurant leur enrichissement postérieures à la sélection à l’aide séquençage de prochaine génération. Les épingles à cheveux enrichis ont été ensuite individuellement validés en testant leur capacité à activer le Rapporteur de la luciférase sur Xi.
Introduction
Une formes les plus courantes de la déficience mentale héréditaire chez les femmes, le syndrome de Rett, est causée par des mutations hétérozygotes MeCP2, un gène du chromosome x codant pour une protéine essentielle pour la fonction neuronale normale1. Une approche potentielle au traitement de ce trouble serait la réactivation de l’allèle sauvage de MeCP2 sur le Xi, comme le rétablissement de MeCP2 expression montre pour inverser les déficits neurologiques dans un modèle murin de cette maladie1, 2 , 4. Toutefois, silençage épigénétique de l’un des deux chromosomes dans les cellules femelles X est solidement maintenu tout au long de la durée de vie d’un organisme3,4, et robuste réactivation d’un gène Xi exigerait un important perturbation dans les multiples voies de régulation épigénétiques.
Pour identifier des facteurs nécessaires pour la maintenance de MeCP2 faire taire, nous avons d’abord développé un modèle de souris transgénique portant une fusion de gène MeCP2– luciférase – hygromycine résistance (MeCP2-LUC-HR) sur l’un des deux chromosomes X (X MeCP2-LUC-HR/xMeCP2)5. Bien que le MeCP2 exprimée à partir de la construction de la fusion s’est avéré pour être instable et a résulté en une perte de fonction, phénotypiquement imitant MeCP2 suppression chez les mâles hémizygotes (X/y deMeCP2-LUC-HR), l’expression des gènes de journaliste est facilement décelable dans un modèle conforme à l’expression d’endogène MeCP25. Nous avons ensuite généré des clones de fibroblastes immortalisé par la construction sur le chromosome x soit active ou inactive et a confirmé que les anciens ont exprimé type sauvage MeCP2 et pas le concept de journaliste ; l’inverse est vrai pour ce dernier. Lorsqu’il est exposé à un ADN demethylation agent connu pour abroger le silençage génique, 5-azacytidine (5-AZA), cellules avec le reporter sur le Xi (« cellules de journaliste ») a acquis l’activité dans un test de bioluminescence, indiquant que notre construction pourrait être réactivée et donc utilisés pour le dépistage génétique.
Ensuite, nous avons développé un dépistage génétique de haut débit pour les régulateurs de MeCP2 mise sous silence. La lignée cellulaire de journaliste était tout d’abord infectée par un rétrovirus bibliothèque contenant > 60 000 différents interférents ciblant > 25 000 gènes tout au long de la souris du génome5,6et ensuite soumis à la sélection de l’hygromycine B. Fréquence en épingle à cheveux a été comparée au préalable et post-sélection échantillons de prochaine génération séquençage, comme reporter réactivation avantageait la croissance sous l’hygromycine B sélection et a donné lieu à l’enrichissement des épingles à cheveux responsables. En utilisant cette approche, nous avons identifié 30 gènes impliqués en MeCP2 silencieux et par la suite ont confirmé les conclusions de la transduction des cellules de journaliste avec des épingles à cheveux et à mesurer leur activité de la luciférase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans notre étude récente6, nous avons généré une lignée de cellules murines avec luciférase et gènes de résistance à l’hygromycine fondues à MeCP2 sur le Xi et il transduites avec une bibliothèque de > 60 000 interférents ciblant > 25 000 gènes. Nous avons trouvé 30 gènes dont un avantage en survie conféré de précipitation sous sélection hygromycine B, suggérant leur rôle dans le contrôle de MeCP2 et silencieux du chromosome x. Ces résultats ont été va…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Ross Dickins de l’Université de Melbourne pour offrir gracieusement la bibliothèque de shARN utilisée dans l’écran. Ce travail a été financé par la Rett Syndrome Research Trust (dossier d’appel).
Materials
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
Riferimenti
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