Evaluación de Dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda
Summary
Aquí describimos los métodos para evaluar la respuesta celular al estímulo mecánico agudo. En el análisis de microscopía, examinamos localización de biosensores marcada con fluorescencia Tras estimulación breve con esquileo del flujo. También probamos la activación de diversas proteínas de interés en respuesta a la estimulación mecánica aguda bioquímicamente.
Abstract
Quimiotaxis, o migración a un gradiente de quimioatractiva, es el mejor modo de entender de migración dirigida. Estudios social ameba Dictyostelium discoideum reveló que una red de transducción de la señal compleja de caminos paralelos amplifica la respuesta a atrayentes y lleva a la polimerización de la actina sesgada y saliente de un seudópodo en la Dirección de un degradado. En cambio, no se conocen mecanismos moleculares conducir otros tipos de migración dirigida, por ejemplo, debido a la exposición a flujo o campos eléctricos, de cizalla. Muchos reguladores de quimiotaxis exhiben localización en el revestimiento de borde o de una migración de la célula, así como mostraron cambios transitorios en la localización o la activación después del estímulo global con un chemoattractant. Para entender los mecanismos moleculares de otros tipos de migración dirigida se desarrolló un método que permite la examinación de la respuesta celular al estímulo mecánico agudo basado en la exposición breve (2-5 s) a flujo del esquileo. Esta estimulación se puede entregar en un canal mientras que las células con marcada con fluorescencia biosensores para examinar el comportamiento de células individuales de la proyección de imagen. Además, la población celular puede ser estimulado en una placa, lisis y immunoblotted utilizando anticuerpos que reconocen las versiones activadas de proteínas de interés. Mediante la combinación de ambos ensayos, uno puede examinar una amplia gama de moléculas activadas por cambios en la localización subcelular o fosforilación. Con este método determinamos que la estimulación mecánica aguda desencadena la activación de las redes de citoesqueleto de actinia y transducción de señal quimiotáctica. La capacidad de examinar las respuestas celulares a la estimulación mecánica aguda es importante para comprender los eventos Inicio necesarios para motilidad inducida por el flujo del esquileo. Este enfoque también proporciona una herramienta para el estudio de la red de transducción de señal quimiotáctica sin la influencia de la confusión del receptor chemoattractant.
Introduction
Migración de las células eucariotas está sesgada por diversas señales químicas y físicas en el medio ambiente, incluyendo gradientes de atrayentes solubles o sustrato enlazado, rigidez variable de los sustratos, campos eléctricos o flujo del esquileo. Aunque ha habido muchos avances en nuestra comprensión de los mecanismos moleculares conduce chemotaxis, menos se sabe acerca de otros tipos de migración dirigida y cómo se integran estas diversas señales a nivel celular para producir un migratorias respuesta.
Dirigido la migración hacia un aumento de la concentración de un chemoattractant implica tres componentes conductuales: motilidad, detección direccional y polaridad1. La motilidad se refiere al movimiento aleatorio de las células mediante protrusión de pseudópodos. Es la capacidad de una célula para detectar la fuente de quimioatractiva de detección direccional, que puede ocurrir incluso en inmovilizado células. La polaridad se refiere a la distribución asimétrica más estable de componentes intracelulares entre el líder y el revestimiento de borde de una célula, que conduce a mayor persistencia en movimiento.
Respuesta celular a un chemoattractant depende de la actividad de redes reguladoras expresiones definidas cuatro: receptor / G proteína, transduction de la señal, citoesqueleto de actina y polaridad1. Chemoattractant atascamiento al receptor acoplado a proteínas G transmite la señal vía heterotriméricas G proteínas α y βγ a la red de transducción de la señal descendente, que amplifica la señal direccional. Múltiples vías dentro de la red de transducción de señal actúan en paralelo y alimentan la red del citoesqueleto de actina y polimerización de la actina sesgo, protrusión de seudópodo consecuente, en la dirección del gradiente. Importantes reguladores de la quimiotaxis son Ras GTPase, TorC2, fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN) y ciclasa guanylyl. Mecanismos de retroalimentación dentro de la red de transducción de señal y la transducción de señales y redes de citoesqueleto de actina más amplifican la respuesta. Finalmente, la red de polaridad mal definida recibe entrada desde el citoesqueleto de actina y sesgos aún más la red de transducción de señal para promover la migración persistente en la dirección del gradiente.
Gran parte de nuestra comprensión mecanicista de la quimiotaxis fue posible debido al desarrollo de biosensores con etiqueta fluorescente para diversos componentes de las redes reguladoras. Muchos reguladores de quimiotaxis tienen una distribución asimétrica de la molécula reguladora de sí mismo o de su actividad. Por ejemplo, biosensores que reconocen activación versiones de pequeño GTPases Ras y Rap1 – dominios de unión a Ras de Raf1 (denominado RBD aquí) y RalGDS, respectivamente-localizar a la vanguardia de una célula chemotaxing2,3. Del mismo modo, PI3K y su producto fosfatidilinositol (3,4,5)-trifosfato (PIP3), reconocido por un dominio de homología (PH) pleckstrin, también Mostrar localización en el frente de una célula4,5. Por el contrario, una 3-fosfatasa PTEN, que convierte PIP3 a fosfatidilinositol (4,5)-bifosfato, se localiza en el borde del revestimiento de la célula6. Lo importante, estos biosensores cambian su localización en la respuesta a la estimulación global con un chemoattractant. Marcadores de vanguardia, citosólico o en las extremidades de salientes en una celda de reclinación, relocalizar a la corteza, mientras que quedándose marcadores del borde, localización cortical y están ausentes de las puntas de salientes en una reclinación de la célula, se convierten en citosol después de estimulación. Análisis de la distribución de biosensor en respuesta a la estimulación global con un chemoattractant minimiza la contribución de motilidad y polaridad, que a menudo confundir las observaciones. Estimulación global o uniforme de una suspensión con un chemoattractant también se utiliza como una herramienta para evaluar los cambios de toda la población en la activación de la proteína, a menudo detectada por fosforilación de proteínas7,8,9 . Este análisis bioquímico se utilizan principalmente para obtener información temporal, mientras que la microscopia se utiliza para recopilar información temporal y espacial sobre el comportamiento de los diversos componentes de las redes reguladoras.
La red de transducción de señal incorpora características de un sistema excitable10,11. Respuestas a los estímulos quimiotácticos supra umbral son “escogiendo” y mostrar períodos refractarios. Las respuestas se desencadenan también estocástico y pueden mostrar comportamiento oscilatorio. Eventos de transducción de señal se localizan en las regiones de la corteza que se propagan como ondas12,13,14,15. Frente, detrás, marcadores son reclutados a o disocian de las zonas activas de las ondas de propagación. Debido a la región refractaria que se arrastra la zona activa, las olas opuesto dirigidas aniquilan como se encuentran. Las olas de transducción de señal propagación subyacen las protuberancias celulares que median la migración de la célula10.
Mucha de la información mencionada en la quimiotaxis vino de los estudios sobre la ameba social discoideum de Dictyostelium, aunque mecanismos regulatorios similares también son aplicables a los neutrófilos y otros tipos de células de mamífero16 . Dictyostelium es un organismo modelo bien establecido que cuenta con una robusta respuesta quimiotáctica durante hambre, cuando miles de células migran hacia un centro de agregación, eventualmente formando un cuerpo fructífero multicelular que contiene esporas. Chemotaxis es también esencial durante la etapa de crecimiento de la célula solo de este organismo para la localización de fuentes de alimentación bacteriana. Lo importante, migración de células de Dictyostelium solo es notable similar a la migración de neutrófilos mamíferos o de las células de cáncer metastásico, que sufren migración ameboides tipo muy rápida. De hecho, tanto la topología global de las redes de regulación, así como muchas de las vías de transducción de señal individuales implicadas en la quimiotaxis se conservan entre Dictyostelium y leucocitos mamíferos17. Además, otras células, como fibroblastos, usan quinasas de tirosina del receptor (RTK) en lugar de GPCRs; sin embargo, RTKs pueden alimentar redes similares.
En contraste con la quimiotaxis, carece de comprensión de los mecanismos de señalización que conducen a otros modos de la migración dirigida. De manera similar a las células que migran en un gradiente chemoattractant varios estudios han reportado activación o localización de marcadores típicos de vanguardia, incluyendo la polimerización de la actina, PIP3 o quinasa regulada por señal extracelular (ERK) 1/2, en el frente de las células que experimentan dirigido migración en respuesta a esfuerzo cortante flujo o cambios en campos eléctricos18,19,20,21. Sin embargo, en estos estudios la exposición continua al estímulo también dio lugar a la migración de la célula, dejando abierta la pregunta si, por ejemplo, los marcadores de punta localización específicamente en respuesta a un estímulo, o si simplemente localiza en el borde de ataque debido a aumento del número de pseudópodos en la parte delantera de una migración de la célula.
Desarrollamos análisis que nos permiten observar la respuesta de las células a perturbación mecánica aguda entregado como esquileo del flujo tanto a nivel poblacional y como células individuales22. Similar a la estimulación global con quimioatractiva, estimulación agudación con esquileo del flujo permite el estudio de la respuesta celular a un estímulo mecánico sin la contribución de la confusión de la motilidad o polaridad. Combinando estos ensayos bioquímicos y microscópicos con perturbaciones genéticas o farmacológicas nos permite aprender sobre estímulos mecánicos cómo se perciben y se transmite. Por otra parte, este enfoque también proporciona un método novedoso para aprovechar el sistema aguas abajo del receptor chemoattractant en ausencia de un chemoattractant, aislando así las señal de transducción y de la actinia citoesqueleto redes de receptor/G red de la proteína.
Utilizando las técnicas descritas a continuación recientemente demostró que corte la tensión aguda conduce a la activación de múltiples componentes de la señal quimiotáctica transducción y actinia citoesqueleto redes22. Mediante la aplicación de la estimulación mecánica aguda a intervalos diferentes, demostramos que, semejantemente a atrayentes, respuesta a estímulos mecánicos también exhibe características de un sistema excitable, incluyendo el comportamiento escogiendo de la respuesta en condiciones de saturación y la presencia de un período refractario. Finalmente, mediante la combinación de estimulación mecánica y química mostramos que dos estímulos comparten señal transducción y actinia citoesqueleto redes, que probablemente permitan la integración de múltiples estímulos a la migración de células de sesgo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos descritos aquí ofrecen una manera conveniente de evaluar población y comportamiento individuales de la célula en respuesta a flujo del esquileo. Lo importante, mientras que estudios previos analizan localización de los principales y marcadores del borde del revestimiento durante la migración, el enfoque actual permite investigación de efectos inmediatos aplicando el flujo de corte agudo. Con este método hemos demostrado que, de hecho, la respuesta inicial de las células para flujo del esquileo no obl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de donación de salud GM118177 R35 para PND.
Materials
| Reagents | |||
| Dextrose | Fisher | D16-1 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Proteose peptone | Fisher | DF0120-17-6 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Yeast extract | Fisher | 50-550-445 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher | S373-500 | Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3) |
| KH2PO4 | Fisher | P386-500 | Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3) |
| Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) | Fisher | ICN10040525 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Peptone (Bacto) | Fisher | DF0118-17-0 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| K2HPO4 | Fisher | P288-100 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| Caffeine | Fisher | O1728-500 | Use to prepare caffeine (step 1.5) |
| cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) | Fisher | 11-680-1100MG | Use to prepare cAMP (step 1.6) |
| Folic acid | Sigma | F7876 | Use to prepare folic acid (step 1.7) |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| NaF | Fisher | S299-100 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Na3VO4 | Fisher | 50-994-911 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Fisher | S390-500 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) | Sigma | 11873580001 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Latrunculin A | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | Use to prepare Latrunculin A (step 1.9) |
| 4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel | Bio-Rad | 3450029 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Polyvinylidene fluoride membrane | Bio-Rad | 1620177 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2060 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody | Cell Signaling | 4370 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) | GE Healthcare | NA934-100UL | Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) | Bio-Rad | 1705060 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) | Pierce | PI46430 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Coomassie Brilliant Blue | Fisher | PI20278 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| K. aerogenes strain (non-pathogenic) | Dicty Stock Center (dictybase.org) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and Equipment | |||
| Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) | New Brunswick Scientific | Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm. | |
| 10 cm Petri dish | Fisher | FB0875712 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-51B | Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2) |
| 35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) | Fisher | 08-772A | Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1) |
| Polystyrene cup (5 mL) | VWR | 13915-985 | Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2) |
| Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) | Ibidi | 10902 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) | Ibidi | 80316 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| 50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) | Ibidi | 10978 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) | Ibidi | 10964 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842). |
| Line for the drain (1.6 mm ID tubing) | Ibidi | 10842 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). |
| Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) | Zeiss | Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5) | |
| UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) | Perkin-Elmer | DM 16000 | An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4) |
| FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan | Eppendorf | 5252000021D and 5192000027 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i). |
| Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) | Eppendorf | 930000035 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3) |
| Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) | Eppendorf | 5242956.003 | Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1) |
| 1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-472 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2) |
| 8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-338 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Analysis Software (Fiji) | NIH | https://fiji.sc/ | Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5) |
| Migration analysis software (Tracking Tool PRO) | Gradientech | http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ | Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4) |
Riferimenti
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