Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta
Summary
Qui descriviamo i metodi per la valutazione della risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta. Nell’analisi della base di microscopia, esaminiamo la localizzazione di biosensori fluorescente etichettati dopo breve stimolazione con flusso di shear. Ci prova anche l’attivazione di varie proteine di interesse in risposta alla stimolazione meccanica acuta biochimicamente.
Abstract
Chemiotassi, o la migrazione a una sfumatura di un fattore chemiotattico, è la modalità migliore capita di migrazione diretto. Gli studi utilizzando ameba sociale Dictyostelium discoideum hanno rivelato che una rete di trasduzione del segnale complesso di vie parallele amplifica la risposta di chemioattrattanti e conduce alla polimerizzazione dell’actina prevenuto e sporgenza di un pseudopodo nella direzione di una sfumatura. Al contrario, i meccanismi molecolari guida altri tipi di migrazione diretto, ad esempio, a causa di esposizione a taglio di flusso o campi elettrici, non sono noti. Molti regolatori di chemiotassi esibiscono localizzazione presso il bordo iniziale o in ritardo di una migrazione delle cellule, come pure mostrano cambiamenti transitori in localizzazione o attivazione dopo stimolazione globale con un fattore chemiotattico. Per comprendere i meccanismi molecolari di altri tipi di migrazione diretto abbiamo sviluppato un metodo che consente l’esame della risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta basata sull’esposizione breve (2-5 s) per la tosatura del flusso. Questa stimolazione può essere trasportata in un canale mentre le cellule che esprimono con etichetta fluorescente biosensori per esaminare il comportamento delle singole celle di imaging. Inoltre, la popolazione delle cellule può essere stimolata in un piatto, lisate e immunoblotted usando gli anticorpi che riconoscono le versioni attive di proteine di interesse. Combinando entrambi i test, si può esaminare una vasta gamma di molecole attivate dai cambiamenti nella localizzazione subcellulare e/o fosforilazione. Utilizzando questo metodo abbiamo determinato che acuta stimolazione meccanica innesca l’attivazione delle reti di citoscheletro l’actina e la trasduzione del segnale chemiotattico. La capacità di esaminare le risposte cellulari agli stimoli meccanici acuta è importante per comprendere l’origine eventi necessari per motilità indotta da flusso di shear. Questo approccio fornisce anche uno strumento per lo studio della rete di trasduzione del segnale chemiotattico senza l’influenza di confusione del recettore chemoattractant.
Introduction
Migrazione delle cellule eucariotiche è prevenuto da diversi stimoli chimici e fisici nell’ambiente, compresi gradienti di chemioattrattanti solubile o associata a substrato, rigidità variabile del flusso di shear, campi elettrici o substrati. Anche se ci sono stati molti progressi nella nostra comprensione dei meccanismi molecolari guida chemiotassi, meno si sa sugli altri tipi di migrazione diretto e come questi segnali diversi sono integrati a livello cellulare per produrre un unificato migratori risposta.
Regia di migrazione verso una crescente concentrazione di un chemoattractant coinvolge tre componenti comportamentali: motilità, rilevamento direzionale e polarità1. Motilità si riferisce al movimento casuale delle cellule raggiunto dalla sporgenza pseudopodo. Rilevamento è la capacità di una cellula per individuare la fonte di un chemoattractant direzionale, che può verificarsi anche in immobilizzato cellule. Polarità si riferisce alla distribuzione asimmetrica più stabile di componenti intracellulari tra il leader e il bordo in ritardo di una cella, che conduce a una maggiore persistenza in movimento.
Risposta cellulare ad un chemoattractant dipende dall’attività delle quattro reti di regolazione concettualmente definiti: recettore / proteina G, trasduzione del segnale, citoscheletro di actina e polarità1. Associazione di fattore chemiotattico per i recettori accoppiati a proteine G trasmette il segnale tramite α proteine G eterotrimeriche e βγ per la rete di trasduzione del segnale a valle, che amplifica il segnale direzionale. Le vie multiple all’interno della rete di trasduzione del segnale agiscono in parallelo e alimentano la rete del citoscheletro di actina per polimerizzazione dell’actina bias e conseguente pseudopodio protrusione, in direzione della sfumatura. Tra importanti regolatori della chemiotassi sono Ras GTPase, TorC2, fosfoinositide 3-chinasi (PI3K), omologo della fosfatasi e tensin (PTEN) e la ciclasi di guanylyl. Meccanismi di feedback all’interno della rete di trasduzione del segnale e tra la trasduzione del segnale e reti di citoscheletro di actina ulteriormente amplificano la risposta. Infine, la rete di polarità mal definiti riceve input dal citoscheletro di actina e ulteriormente biases rete di trasduzione del segnale per promuovere la migrazione persistente nella direzione della sfumatura.
Gran parte della nostra comprensione meccanicistica della chemiotassi è stato reso possibile a causa dello sviluppo di biosensori fluorescente contrassegnati per i vari componenti delle reti di regolamentazione. Molti regolatori di chemiotassi hanno una distribuzione asimmetrica la molecola regolamentazione stessa o la sua attività. Ad esempio, biosensori che riconoscono attivato versioni di piccolo GTPases Ras e Rap1 – Ras-associazione domini di Raf1 (denominato RBD qui) e RalGDS, rispettivamente – localizzare a bordo di una cella di chemotassi2,3. Allo stesso modo, PI3K e suo prodotto fosfatidilinositolo (3, 4,5)-trifosfato (PIP3), riconosciuto da un dominio di omologia (PH) di pleckstrin, mostrano anche la localizzazione nella parte anteriore di una cella4,5. Al contrario, un 3-fosfatasi PTEN, che converte il PIP3 torna a fosfatidilinositolo (4,5)-bisphosphate, si localizza al bordo della cella6in ritardo. D’importanza, questi biosensori cambiano loro localizzazione in risposta alla stimolazione globale con un fattore chemiotattico. Marcatori di avanguardia, che sono citosolici o sulle punte delle sporgenze in una cella di riposo, rilocalizzare alla corteccia, considerando che in ritardo di marcatori di bordo, che hanno localizzazione corticale e sono assenti dalle punte delle sporgenze in una cella di riposo, diventano citosolico dopo stimolazione. Analisi della distribuzione di biosensore in risposta alla stimolazione globale con un chemoattractant riduce al minimo il contributo della motilità e della polarità, che spesso confondono le osservazioni. Stimolazione globale o uniforme di una sospensione di cellule con un chemoattractant è utilizzata anche come strumento per valutare i cambiamenti di tutta la popolazione nell’attivazione di proteine, spesso rilevato da proteina fosforilazione7,8,9 . Questa analisi biochimica viene utilizzata principalmente per ottenere informazioni temporali, mentre microscopia viene utilizzata per raccogliere informazioni spaziali e temporali sul comportamento dei vari componenti delle reti di regolamentazione.
Rete di trasduzione del segnale incorpora le caratteristiche di un sistema eccitabile10,11. Le risposte agli stimoli chemiotattici supra-soglia sono “definitiva” e visualizzare i periodi refrattari. Le risposte vengono anche attivate casualmente e possono mostrare comportamento oscillatorio. Eventi di trasduzione del segnale sono localizzati nelle regioni della corteccia che si propagano come onde12,13,14,15. Anteriore, indietro, marcatori sono reclutati per o dissociano da, zone attive delle onde moltiplicazione. A causa della regione refrattaria finali della zona attiva, le onde in modo opposto dirette annichilano come si incontrano. La moltiplicazione delle onde di trasduzione di segnale sottendono le sporgenze cellulari che mediano la cella migrazione10.
Molte delle suddette informazioni su chemiotassi è venuto dagli studi sull’ameba sociale Dictyostelium discoideum, anche se simili meccanismi regolatori sono applicabili anche ai neutrofili e altri tipi di cellule di mammifero16 . Dictyostelium è un organismo modello ben consolidata che ha una robusta risposta chemiotattica durante l’inedia, quando migliaia di singole cellule di migrazione verso un centro di aggregazione, alla fine formano un corpo fruttifero multicellulare contenente spore. La chemiotassi è essenziale anche durante la fase di crescita di singola cellula di questo organismo per l’individuazione di fonti di cibo batterica. D’importanza, la migrazione di singole cellule di Dictyostelium è notevolmente simile alla migrazione di mammiferi neutrofili o cellule tumorali metastatiche, i quali subiscono molto rapida migrazione ameboide-tipo. Infatti, entrambi la topologia globale delle reti regolamentari, così come molte delle vie di trasduzione del segnale individuali coinvolte nella chemiotassi sono conservate tra Dictyostelium e leucociti mammiferi17. Inoltre, altre cellule, come i fibroblasti, utilizzano recettori tirosin chinasici (RTK) invece di GPCR; Tuttavia, RTK può alimentano reti simili.
A differenza di chemiotassi, conoscenza approfondita dei meccanismi di segnalazione che guidano varie altre modalità di migrazione diretto è carente. Analogamente alle cellule la migrazione in una sfumatura di chemoattractant parecchi studi hanno riferito l’attivazione e/o localizzazione di marcatori tipici all’avanguardia, tra cui polimerizzazione dell’actina, PIP3 e/o chinasi segnale-regolata extracellulare (ERK) 1/2, presso il parte anteriore delle cellule che subiscono diretto migrazione in risposta a taglio di flusso o modifiche in campi elettrici18,19,20,21. Tuttavia, in questi studi l’esposizione allo stimolo ha provocato anche nella migrazione cellulare, lasciando aperta la questione se, ad esempio, i marcatori di avanguardia localizzare specificamente in risposta ad uno stimolo, o se semplicemente si localizza all’avanguardia a causa di aumento del numero di pseudopodi nella parte anteriore di una migrazione delle cellule.
Abbiamo sviluppato le analisi che ci permettono di osservare la risposta delle cellule a perturbazione meccanica acuta inviati come flusso di shear sia a livello di popolazione e come singole celle22. Simile alla stimolazione globale con un chemoattractant, stimoli acutizione con flusso di shear permette lo studio di una risposta cellulare ad uno stimolo meccanico senza il contributo di confondimento da motilità o polarità. Combinando questi saggi biochimici e microscopici con perturbazioni genetiche o farmacologiche permette di imparare a stimoli meccanici come sono percepiti e trasmessi. Inoltre, questo approccio fornisce anche un metodo novello per attingere il sistema a valle del recettore chemoattractant in assenza di un fattore chemiotattico, isolando quindi le reti di citoscheletro l’actina e la trasduzione del segnale dal recettore/G rete di proteina.
Utilizzando le tecniche descritte qui di seguito abbiamo recentemente dimostrato che acuta lo shear stress conduce all’attivazione di più componenti del segnale chemiotattico trasduzione e l’actina citoscheletrica reti22. Applicando lo stimolo meccanico acuto a intervalli variabili, abbiamo dimostrato che, analogamente ai segnalanti, risposta agli stimoli meccanici anche esibisce caratteristiche di un sistema eccitabile, incluso il comportamento definitivo della risposta sotto saturando le condizioni e la presenza di un periodo refrattario. Infine, mediante la combinazione di stimolazione meccanica e chimica abbiamo mostrato che i due stimoli condividano segnale trasduzione e actina citoscheletrica reti, che probabilmente consentono l’integrazione di molteplici stimoli per migrazione delle cellule di sbieco.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi descritti qui offrono un modo pratico per valutare la popolazione e comportamento delle singole celle in risposta a di taglio di flusso. D’importanza, mentre gli studi precedenti analizzati localizzazione dei principali e in ritardo di marcatori di bordo durante la migrazione, l’attuale approccio permette di indagine degli effetti immediati applicando il flusso di shear acutamente. Usando questo metodo abbiamo dimostrato che, in realtà, la risposta iniziale delle cellule per la tosatura del flusso non richiede …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzione di salute R35 GM118177 a PND.
Materials
| Reagents | |||
| Dextrose | Fisher | D16-1 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Proteose peptone | Fisher | DF0120-17-6 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Yeast extract | Fisher | 50-550-445 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher | S373-500 | Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3) |
| KH2PO4 | Fisher | P386-500 | Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3) |
| Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) | Fisher | ICN10040525 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Peptone (Bacto) | Fisher | DF0118-17-0 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| K2HPO4 | Fisher | P288-100 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| Caffeine | Fisher | O1728-500 | Use to prepare caffeine (step 1.5) |
| cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) | Fisher | 11-680-1100MG | Use to prepare cAMP (step 1.6) |
| Folic acid | Sigma | F7876 | Use to prepare folic acid (step 1.7) |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| NaF | Fisher | S299-100 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Na3VO4 | Fisher | 50-994-911 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Fisher | S390-500 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) | Sigma | 11873580001 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Latrunculin A | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | Use to prepare Latrunculin A (step 1.9) |
| 4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel | Bio-Rad | 3450029 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Polyvinylidene fluoride membrane | Bio-Rad | 1620177 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2060 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody | Cell Signaling | 4370 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) | GE Healthcare | NA934-100UL | Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) | Bio-Rad | 1705060 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) | Pierce | PI46430 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Coomassie Brilliant Blue | Fisher | PI20278 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| K. aerogenes strain (non-pathogenic) | Dicty Stock Center (dictybase.org) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and Equipment | |||
| Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) | New Brunswick Scientific | Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm. | |
| 10 cm Petri dish | Fisher | FB0875712 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-51B | Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2) |
| 35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) | Fisher | 08-772A | Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1) |
| Polystyrene cup (5 mL) | VWR | 13915-985 | Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2) |
| Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) | Ibidi | 10902 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) | Ibidi | 80316 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| 50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) | Ibidi | 10978 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) | Ibidi | 10964 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842). |
| Line for the drain (1.6 mm ID tubing) | Ibidi | 10842 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). |
| Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) | Zeiss | Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5) | |
| UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) | Perkin-Elmer | DM 16000 | An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4) |
| FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan | Eppendorf | 5252000021D and 5192000027 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i). |
| Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) | Eppendorf | 930000035 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3) |
| Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) | Eppendorf | 5242956.003 | Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1) |
| 1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-472 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2) |
| 8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-338 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Analysis Software (Fiji) | NIH | https://fiji.sc/ | Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5) |
| Migration analysis software (Tracking Tool PRO) | Gradientech | http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ | Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4) |
Riferimenti
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