הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי Elutriation
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש elutriation צנטריפוגלי כדי להפריד בין תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרי לשלבים שונים של מחזור התא.
Abstract
היכולת לסנכרן את התאים כבר מרכזי לקידום ההבנה שלנו של מחזור התא רגולציה. טכניקות נפוצות המועסקים כוללים קיפוח סרום; כימיקלים אשר לעצור תאים בכל שלבי מחזור התא שונים; או השימוש mitotic לנער-off המנצלת שדבקו מופחת. אולם, כל אלה יש חסרונות. לדוגמה, סרום הרעבה עובד היטב עבור תאים נורמליים, אבל פחות טוב של תאים סרטניים עם מחזור התא פרוץ המחסומים בשל אובדן משתיק קול ההפעלה או גידול אונקוגן. באופן דומה, אוכלוסיות תאים טיפול כימי יכול הנמל נזק שיכרון ולהראות שינויים הקשורות במתח. טכניקה אשר עוקף בעיות אלה הוא counterflow elutriation צנטריפוגליות (להרדים), שבו תאים נחשפים שני הכוחות המנוגדים, כוח צנטריפוגלי, מהירות נוזלים, כשהתוצאה היא ההפרדה של תאים על בסיס גודל וצפיפות. מאז תאים לקדם באמצעות המחזור בדרך כלל להגדיל, להרדים יכול לשמש כדי להפריד בין תאים לשלבים שונים של מחזור התא. כאן אנו מיישמים את הטכניקה הזו לתאים העיקרי לוקמיה לימפובלסטית חריפה. בתנאים אופטימליים, אוכלוסיה בעיקרו של דבר טהור של תאים בשלב G1 ואת אוכלוסיה מועשר של תאים בשלבים G2/M ניתן להשיג תשואה מעולה. אוכלוסיות תאים אלה מתאימים באופן אידיאלי עבור לימוד תלויי-מחזור התא מנגנוני הפעולה של תרופות נגד סרטן, יישומים אחרים. אנחנו גם להראות כיצד שינויים הליך סטנדרטי יכול לגרום בביצועים שיוצרת ולדון את המגבלות של הטכניקה. המתודולוגיה מפורט שהוצג צריך לאפשר יישום וחקירה של הטכניקה סוגים אחרים של תאים.
Introduction
תאים בתרבית בדרך כלל לגדול באופן אסינכרוני, תאים בודדים נמצאים בשלבים שונים של מחזור התא. אורגניזמים מסוימים ייתקלו מחזורי תאים סינכרונית באופן טבעי או ניתן לסנכרן באמצעות ספציפית לגירויים פיזיולוגיים. לדוגמה, גרעינים בתוך plasmodia ענק התבנית רפש Physarum polycephalum לחלק אופנה מאוד סינכרונית1, וכן תאים של האצות הירוק שניתן לסנכרן Desmodesmus quadricauda , לסירוגין כהה תקופות2. בעוד אורגניזמים כגון מציעים תכונות ניסויית ייחודית, הם מודל כראוי המורכבות של תאי יונקים. היכולת לסנכרן באופן מלאכותי בתרבית של תאים אוכלוסיות כבר מרכזי לקידום ההבנה שלנו של מחזור התא רגולציה, הבסיס המולקולרי של מחזור התא מחסומים. שיטות נפוצות כוללות מניעת סרום, בלוק כימי, שחרור, או ניצול מאפיינים פיזיים3,4. נסיגה של סרום גורם לעתים קרובות תאים להזין תרדמה ולאחר התוספת מחדש של סרום מקדם החזרה מחזור התא לתוך שלב G15. מעכבי כימי כוללות סוכני כגון עודף תימידין הידרוקסיוראה החוסמות תאים על הגבול G1/S, או מעכבי microtubule אשר בדרך כלל לעצור התאים ב-3,שלב4מ’. גישות לנצל תכונות פיזיות כוללות mitotic לנער את אשר יכול לשמש כדי להעשיר תאים mitotic מכיוון שהן פחות חסיד מאשר לאטמוספרה תאים6. אולם, כל הטכניקות הללו יש החסרונות פוטנציאל. לדוגמה, לא כל סוגי תאים לשמור על הכדאיות העדר של סרום או הנוכחות של מעכבי כימי, וכן את התשואה של התאים לאחר mitotic לנער-לא מוגבל ללא סינכרון מוקדמת עם מעכבי mitotic.
למעט בתחילת מחזורי תאים עובריים, שבו תאים בהדרגה להקטנת גודל כפי הם מחלקים7, רוב התאים לקדם באמצעות המחזור עוברים שלבי גידול ולהיות גדול יותר. מאפיין זה הוא לנצל את הטכניקה של counterflow צנטריפוגלי elutriation (להרדים), אשר יכול לשמש כדי להפריד בין תאים שונות בגודל, ומכאן במחזור התא שלב8,9. במהלך. להרדים, התאים נמצאים תחת ההשפעה של שני כוחות מנוגדים: כוח צנטריפוגלי, אשר כוננים התאים מחוץ לציר הסיבוב, והמהירות נוזל (counterflow), אשר מניע את התאים לכיוון לציר הסיבוב (איור 1). תאים במחסנית elutriation להגיע למשרת שיווי משקל שבו כוחות אלה הם שווים. גורמי מפתח מכתיב את מיקום שיווי משקל הם התא קוטר וצפיפות. כמו הזרם גדל קצב של הפתרון מאגר כוח גרירה counterflow עולה הדיסקה, נוצר שיווי משקל חדש, גרימת שינוי בעמדה של תאים בתוך החדר. כל התאים יוזזו לכיוון היציאה קאמרית, וכתוצאה מכך הקטנים עוזב את החדר קודם, ואילו התאים גדול יותר להישאר בתוך החדר עד שער counterflow הוא גדל מספיק כדי לקדם את היציאה שלהם. ניתן לאסוף תאי בריחה תא elutriation עם עליות רצופות קצב counterflow בחלקים ספציפיים ומכיל כל השבר תאים ברצף הולך וגובר גדלים. במקום ניצוח elutriation עם עליות מצטבר counterflow קצב, ירידות רציפים כוח צנטריפוגלי על ידי הפחתת מהירות צנטריפוגה תוכלו להשיג את אותה תוצאה. התהליך של elutriation דורש אופטימיזציה בהתאם סוג התא, מאגר elutriation המועסקים מנגנון ספציפי משמש. הקצב של שיקוע של תאים בתנאים אלה מתואר על ידי חוק סטוקס מיטב: SV = [d2(ρp– ρמ’) / 18η] .ω2r, איפה SV = מהירות שיקוע; d = קוטר של החלקיק; Ρp = צפיפות של החלקיק; Ρm = צפיפות של המאגר; Η = צמיגות של המאגר; Ω = מהירות זוויתית של הרוטור; ו- r = רדיאלי המיקום של החלקיק. לפיכך, SV הוא יחסי התא קוטר וצפיפות, מאז קוטר הוא בחזקת השני, תורם יותר משמעותית מאשר צפיפות אשר הוא בדרך כלל קבוע דרך מחזור התא.
יתרון חשוב של להרדים הוא תאים לא נתון את התנאים הקשים של טיפול כימי או מחסור תזונתי, ניתן לשחזר בעיקרו בשלוות נפש מעולה כממוצע. דרישה הוא בתאים עוברים עלייה משמעותית בקוטר לפחות 30%, כפי שהם חוצים את מחזור התא. החיסרון העיקרי הוא העלות של צנטריפוגה מיוחדים, רוטור, אביזרים. למרות זאת, היכולת להכין תאים מועשר בשלבים מסוימים מחזור התא על-ידי. להרדים במידה רבה הנחתה את מחזור התא במחקר האורגניזמים שמרים בתרבית של תאים9,10. יתר על כן, ההתקדמות מתרחבים שימושים הפרדת תאים מן בריא לעומת רקמה סרטנית, ההפרדה של סוגי תאים שונים בתערובות הטרוגניות ולאחר לייצור של סוגי תאים ספציפיים חיסוני9.
האינטרס העיקרי שלנו כבר בהבנת מנגנון הפעולה של microtubule מיקוד סוכנים (MTAs) כגון וינקה אלקלואידים, taxanes. תרופות אלו נחשבו לפעול באופן בלעדי מיטוזה, חסימת צירים microtubule פונקציה11,12, אך לאחרונה העדויות שהם גם עשויים למקד לאטמוספרה microtubules13,14. לאחרונה דיווחנו כי ראשי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) תאים עוברים מוות בכל שלב G1 או ב- M שלב כאשר שטופלו vincristine ו MTAs אחרים באופן תלוי-מחזור התא15. היכולת להפריד בין כל התאים לשלבים שונים מחזור התא על ידי להרדים היה אינסטרומנטלי להגיע מסקנה זו. במאמר זה, אנו מתארים את הפרטים הטכניים, מציעים טיפים מעשיים עבור היישום של. להרדים הכנת ראשי כל התאים בשלבים שונים של מחזור התא.
Protocol
Representative Results
Discussion
תארנו שיטה להשגת ראשי כל התאים בשלבים שונים של מחזור התא באמצעות להרדים. בתנאים אופטימליים אוכלוסיה בעיקרו של דבר טהור של תאים בשלב G1 ואת אוכלוסיה מועשר של תאים בשלבים G2/M יכול בקלות להשיג תשואה מעולה, התאים מועשרים מאוד בשלב זה גם ניתן להשיג אם רצונך בכך. התוצאות המובאות כאן התקבלו באמצעות…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH CA109821 (כדי TCC). אנו מודים Beckman Coulter בנדיבות תקציבים כדי לכסות את עלויות הפרסום, לקבלת סיוע טכני בארצות ותפעול של מערכת elutriation. אנו מודים ד ר פרד Falkenburg למתן הראשית הראשונית בכל התרבויות.
Materials
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD – 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
Riferimenti
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
- Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
- Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
- Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
- Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
- Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
- Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
- Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
- Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
- Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
- Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
- Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
- Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
- Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).
