기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리
Summary
이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.
Abstract
Acellular 기질 준비 세포-매트릭스 상호 작용을 공부 하는 데 유용 하 고 재생 세포 치료 응용 프로그램을 용이 하 게. 여러 상업 기질 제품 hydrogels 또는 막, 사용할 수 있지만 이러한 조직 관련 생물 활성을가지고 있지 않습니다. 불가능 하기 때문에 관류 decellularization 일반적으로 인간의 심장 조직으로, 우리는 3 단계 집중 decellularization 프로세스를 개발 했다. 인간의 심근 조각 수술 중 조달 먼저 세제 무료 hyperosmolar 세포의 용 해 버퍼, 이온 세제, 나트륨 라우릴 황산 염와 부 화 다음으로 취급 되 고 과정의 본질적인 DNase 활동을 이용 하 여 완료 되 면 태아 둔감 한 혈 청입니다. 이 기술은 결과 심장 세포 외 매트릭스의 셀 무료 시트에 주로 섬유 조직 아키텍처 biopolymer 구성 유지는 심장 세포 인구를 pluripotent 줄기 특정 환경 단서를 제공 하기 위해 표시 했다 셀입니다. 심장 세포 외 기질 시트 다음 추가 추가 화학 수정 없이 microparticle 분말으로 처리 하거나 수, 단기 펩 신 소화를 통해와 자가 조립 심장 세포 외 기질 히드로로 보존 bioactivity입니다.
Introduction
세포 외 기질 (ECM) 뿐만 아니라 구조 지원 하지만 생물 학적 세포에 대 한 중요 및 조직 기능1을 제공 합니다. 에, ECM 등 섬유 증, 염증, 신생, cardiomyocyte 수축 기능 및 생존 능력, 주민 조상 세포 운명 pathophysiologic 응답의 규칙에 참여합니다. 그것의 기본 구성 요소-섬유 glycoproteins, 있다, proteoglycans-분 비 성장 인자, cytokines, 및 포함 하는 핵 산 및 단백질2,3막 소포를 포함 합니다.
그것은 최근에 분명 acellular ECM 준비 하지만 공부 뿐만 아니라 잠재적인 치료 셀 기반 응용 프로그램에 대 한 세포-매트릭스 상호 작용에 대 한 귀중 한 되고있다. 치료 셀 제품 또는 설계 조직에 적절 한 환경을 제공의 중요성은 이제 널리 인정 했다. 정의 된 biopolymeric hydrogels4,,56 또는 단백질 칵테일 murine 육 종 세포 (즉, Matrigel, Geltrex)에 의해 분 비 세포 현 탁 액 또는 활성 화합물을 결합 하려는 시도가 되었습니다. 그러나 7., 전 bioactivity 제한, 후자는 GMP 급 프로세스에 문제가 및 둘 다 부족 심장 ECM (cECM)8,,910, 의 조직-특정 bioactivity 11,,1213.
심근의 decellularization 이전 관상 맥 관 구조14,15통해 전체 심장의 관류에 의해 수행 되었습니다. 그러나이 동물 마음에 가능한, 그대로 인간 심 혼 거의 사용할 수 있습니다. 따라서, 수술 실에서 얻은 조직 샘플 처리에 대 한 허용 하는 집중 과정 선호 했다. 우리의 “3 단계” 프로토콜 포함 되어 있습니다 3 별도 인큐베이션 단계 즉 세포, 가용 화, 및 DNA 제거. 그것은 크게 보존된 단백질과 glycosaminoglycan 구성16,17와 인간 심근 ECM을 생성합니다. 이러한 cECM 슬라이스 체 외에서 세포-매트릭스 상호 작용의 연구에 대 한 허용 하지만 제대로 잠재적인 인간 규모 치료 응용 프로그램에 적합. 제조 프로세스는 동결 건조 된 cECM 미 또는 cECM 하이드로 겔18다음 확장 되었다.
이 프로토콜은 심근 세포 외 기질 (ECM) 및 그들의 생물 학적 활동의 주요 구성 요소를 보존 하는 수술 샘플에서 얻은 인간 심근의 decellularization에 대 한 수 있습니다. 보존된 조직-특정 bioactivity와 인간의 심장 ECM는 세포-매트릭스 상호 작용의 실험 연구에 필요한 또는 심근 재생 세포 기반 접근 방법에 대 한 적합 한 환경이 필요한 경우,이 프로토콜에 것이 좋습니다. 원칙적으로, 그것은 또한이 프로토콜 GMP 급 조건에 적응할 수 있도록 처리 된 cECM의 사용 가능한 미래에 치료 응용 해야.
Protocol
Representative Results
Discussion
다음을 달성 하는 목표는 인간의 심근 ECM를 준비할 때: 관련 된 면역성 세포 소재, ECM 무결성 및 bioactivity, 불 임, GMP 공정 호환성, 최종 제품의 비 독성의 보존의 제거 및 처리 측면에서 특정된 응용 프로그램에 대 한 제품의 적합성. 미 또는 자가 조립 히드로 처리 된 우리의 3 단계 decellularization 프로토콜을 결합 하 여 인간의 심장 ECM 소재 얻은 특정 생물 학적 활동을 보유 하 고, 처리 하 고, 쉽게에…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구 프로토콜 헬싱키의 선언에 명시 된 윤리 원칙을 준수 합니다. 환자는 연구 목적, 조직의 사용에 대 한 동의 제공 하 고 조직의 컬렉션 과정 기관 검토 위원회의 Charité-Universitätsmedizin 베를린 (EA4/028/12)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
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