Verwerking van menselijke cardiale weefsels richting de extracellulaire Matrix zelf monteren Hydrogel voor In Vitro en In Vivo toepassingen
Summary
Dit protocol beschrijft de complete decellularization van menselijke myocard met behoud van de componenten van de extracellulaire matrix. Verdere verwerking van de resultaten van de extracellulaire matrix in de productie van deeltjes en een cytoprotective zelfassemblerende hydrogel.
Abstract
Acellulair extracellulaire matrix preparaten zijn nuttig voor het bestuderen van de cel-matrix interacties en regeneratieve cel therapie toepassingen vergemakkelijken. Verschillende commerciële extracellulaire matrixproducten zijn beschikbaar als hydrogels of membranen, maar deze niet beschikken over weefsel-specifieke biologische activiteit. Want perfusie decellularization meestal niet mogelijk met menselijke hartweefsel is, ontwikkelden we een 3-stap onderdompeling decellularization proces. Menselijke myocardiale segmenten aangeschaft tijdens een operatie worden eerst behandeld met wasmiddel-vrije hyperosmolar lysis-buffermengsel, gevolgd door incubatie met de Ionische detergent, natrium dodecyl sulfaat, en het proces is voltooid door te profiteren van de intrinsieke activiteit van de DNase van foetale runderserum. Deze techniek resulteert in cel-gratis bladen van cardiale extracellulaire matrix met grotendeels bewaard vezelig weefsel architectuur en biopolymeer samenstelling, die getoond werden specifieke milieu signalen doorgeven aan cardiale cel populaties en pluripotente stamcellen cellen. Cardiale extracellulaire matrix bladen kunnen vervolgens worden verder verwerkt tot een poeder microparticle zonder verdere chemische modificatie, of, via korte pepsine spijsvertering, in een zelfassemblerende cardiale extracellulaire matrix hydrogel met verduurzaamd topicale.
Introduction
De extracellulaire matrix (ECM) biedt niet alleen structurele ondersteuning maar is ook belangrijk voor biologische cel en weefsel functioneren1. In het hart participeert de ECM in de regulering van de pathofysiologische reacties zoals fibrose, ontsteking angiogenese, cardiomyocyte contractiele functie en levensvatbaarheid en resident progenitor cel lot. Naast haar primaire onderdelen – vezelig glycoproteïnen glycosaminoglycanen en proteoglycans – bevat het een heleboel secreted groeifactoren en cytokines membraanachtig blaasjes met nucleïnezuren en proteïnen2,3.
Het is onlangs duidelijk dat Acellulair ECM preparaten niet alleen zijn voor het bestuderen van de cel-matrix interacties, maar ook voor potentiële therapeutische cel-gebaseerde toepassingen van onschatbare waarde geworden. Het belang van een adequate omgeving naar therapeutische cel producten of gemodificeerde weefsels wordt nu algemeen erkend. Pogingen hebben gedaan om te combineren cel suspensies of actieve samenstellingen met gedefinieerde biopolymeric hydrogels4,5,6 of met eiwit cocktails uitgescheiden door lymfkliertest Sarcoom cellen (dat wil zeggen, Matrigel, Geltrex) 7. de voormalige topicale hebben beperkt, de laatste zijn echter problematisch in GMP-grade processen, en beide ontbreken de weefsel-specifieke topicale van cardiale ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Decellularization van het myocardium is eerder uitgevoerd door perfusie van het hele hart via de coronaire therapieën14,15. Hoewel dit mogelijk is in dierlijke harten, zijn intact menselijke harten zelden beschikbaar. Dus, een onderdompeling proces waarmee voor de behandeling van weefselmonsters verkregen in de operatiekamer was favoriet. Onze “3-stap” protocol bevat 3 aparte incubatie stappen namelijk lysis van de solubilisatie en DNA-verwijdering. Het levert de menselijke myocardiale ECM met grotendeels bewaard gebleven eiwitten en glycosaminoglycaan samenstelling16,17. Deze cECM segmenten toestaan voor in vitro studies van cel-matrix interacties, maar zijn slecht geschikt voor potentiële therapeutische toepassingen van de mens-schaal. Het productieproces werd vervolgens uitgebreid produceren gelyofiliseerd cECM microdeeltjes of een cECM hydrogel18.
Dit protocol voorziet in de decellularization van menselijke myocard verkregen chirurgische monsters, behoud van de hoofdcomponenten van myocardiale extracellulaire matrix (ECM) en hun biologische activiteit. Dit protocol is aanbevolen wanneer menselijke cardiale ECM met bewaarde weefsel-specifieke topicale is vereist voor experimentele studies van cel-matrix interacties, of wanneer een geschikt milieu voor cel-gebaseerde regeneratie van het myocardium benaderingen nodig is. In principe is het ook mogelijk om aan te passen van dit protocol aan GMP-grade omstandigheden, zodat het gebruik van verwerkte cECM haalbaar voortaan therapeutische toepassingen moet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij de voorbereiding van menselijke myocardiale ECM, het doel is het bereiken van het volgende: verwijdering van relevante immunogene celmateriaal, behoud van ECM integriteit en topicale, steriliteit, niet-giftigheid van het eindproduct, GMP-proces-compatibiliteit, en geschiktheid van het product voor een bepaalde toepassing op het gebied van de behandeling. Door het combineren van ons 3-staps decellularization protocol met verdere verwerking in microdeeltjes of zelfassemblerende hydrogel, menselijk cardiale ECM materiaa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het studie-protocol voldoet aan de ethische beginselen die worden beschreven in de verklaring van Helsinki. Patiënten geboden geïnformeerde toestemming voor het gebruik van het weefsel voor onderzoeksdoeleinden, en het proces van weefsel collectie werd goedgekeurd door de institutionele Review Board en de ethische commissie van Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12).
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
Riferimenti
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
