Summary

Extracellular मैट्रिक्स की ओर मानव कार्डियक ऊतक के प्रसंस्करण स्व-कोडांतरण Hydrogel के लिए इन विट्रो में और Vivo में अनुप्रयोगों

Published: December 04, 2017
doi:

Summary

यह प्रोटोकॉल अपने extracellular मैट्रिक्स घटकों के संरक्षण के दौरान मानव मायोकार्डियम की पूरी decellularization का वर्णन करता है । आगे की प्रोसेसिंग extracellular मैट्रिक्स microparticles के उत्पादन में परिणाम और एक cytoprotective स्व-कोडांतरण hydrogel ।

Abstract

Acellular extracellular मैट्रिक्स तैयारी सेल-मैट्रिक्स बातचीत का अध्ययन करने और reअपक्षय सेल थेरेपी अनुप्रयोगों की सुविधा के लिए उपयोगी होते हैं । कई वाणिज्यिक extracellular मैट्रिक्स उत्पाद hydrogels या झिल्ली के रूप में उपलब्ध हैं, लेकिन इन ऊतक विशिष्ट जैविक गतिविधि के अधिकारी नहीं है । क्योंकि छिड़काव decellularization मानव हृदय ऊतक के साथ आम तौर पर संभव नहीं है, हम एक 3 कदम विसर्जन decellularization प्रक्रिया विकसित की है । मानव रोधगलन सर्जरी के दौरान खरीद के पहले डिटर्जेंट के साथ इलाज कर रहे है मुक्त hyperosmolar lysis बफर, ईओण डिटर्जेंट, सोडियम dodecyl सल्फेट के साथ गर्मी के बाद, और इस प्रक्रिया के आंतरिक DNase गतिविधि का दोहन द्वारा पूरा हो गया है भ्रूण गोजातीय सीरम । इस तकनीक के सेल में परिणाम-कार्डियक extracellular मैट्रिक्स के मुक्त चादरें मोटे तौर पर संरक्षित रेशेदार ऊतक वास्तुकला और पॉलिमर संरचना है, जो कार्डियक सेल आबादी और pluripotent स्टेम करने के लिए विशिष्ट पर्यावरणीय cues प्रदान करने के लिए दिखाए गए के साथ कोशिकाओं. कार्डिएक extracellular मैट्रिक्स चादरें तो आगे रासायनिक संशोधन के बिना एक microparticle पाउडर में संसाधित किया जा सकता है, या, अल्पकालिक पेप्सिन पाचन के माध्यम से, एक आत्म में संरक्षित के साथ कार्डियक extracellular मैट्रिक्स hydrogel कोडांतरण ।

Introduction

extracellular मैट्रिक्स (ECM) न केवल संरचनात्मक समर्थन प्रदान करता है, लेकिन जीवविज्ञान सेल और ऊतक समारोह के लिए भी महत्वपूर्ण है1. दिल में, ECM फाइब्रोसिस, सूजन, angiogenesis, cardiomyocyte सिकुड़ा समारोह और व्यवहार्यता के रूप में pathophysiologic प्रतिक्रियाओं के विनियमन में भाग लेता है, और निवासी जनक सेल भाग्य । रेशेदार नच, glycosaminoglycans, और proteoglycans-इसके प्राथमिक घटकों के अलावा-यह स्रावित विकास कारकों, साइटोकिंस, और झिल्लीदार बुलबुले युक्त न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन2,3के एक मेजबान शामिल हैं ।

यह हाल ही में स्पष्ट हो गया है कि acellular ECM तैयारी केवल सेल मैट्रिक्स बातचीत का अध्ययन करने के लिए अमूल्य नहीं हैं, लेकिन यह भी संभावित चिकित्सीय कोशिका आधारित अनुप्रयोगों के लिए । चिकित्सकीय सेल उत्पादों या इंजीनियर ऊतकों के लिए एक पर्याप्त वातावरण प्रदान करने के महत्व को अब व्यापक रूप से स्वीकार किया है । प्रयत्न सेल सस्पेंशन या सक्रिय यौगिकों के साथ परिभाषित किया गया है के साथ मिश्रित पॉलिमर hydrogels4,5,6 या प्रोटीन कॉकटेल के साथ murine सार्कोमा कोशिकाओं (यानी, Matrigel, Geltrex द्वारा स्रावित) 7. हालांकि, पूर्व सीमित है, गैर गतिविधि है, बाद जीएमपी में समस्याग्रस्त ग्रेड प्रक्रियाओं रहे हैं, और दोनों के ऊतकों की कमी-कार्डियक ECM (cECM) के विशिष्ट की गैर-गतिविधि है,8,9,10, 11,12,13.

मायोकार्डियम के Decellularization पहले कोरोनरी vasculature14,15के माध्यम से पूरे दिल के छिड़काव द्वारा प्रदर्शन किया गया है । हालांकि यह जानवर दिलों में संभव है, बरकरार मानव दिल शायद ही कभी उपलब्ध हैं । इसलिए, एक विसर्जन प्रक्रिया है कि ऊतक ऑपरेटिंग कमरे में प्राप्त नमूनों से निपटने के लिए अनुमति देता है इष्ट था । हमारे “3 कदम” प्रोटोकॉल अर्थात् lysis, solubilization, और डीएनए हटाने 3 अलग मशीन कदम शामिल हैं । यह काफी हद तक संरक्षित प्रोटीन और glycosaminoglycan संरचना16,17के साथ मानव रोधगलन ECM पैदावार । इन cECM स्लाइसें सेल-मैट्रिक्स बातचीत के इन विट्रो अध्ययनों में के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन खराब संभावित मानव पैमाने चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं । विनिर्माण प्रक्रिया तो lyophilized cECM microparticles या एक cECM hydrogel18उत्पादन के लिए बढ़ाया गया था ।

इस प्रोटोकॉल मानव मायोकार्डियम शल्य चिकित्सा नमूनों से प्राप्त की decellularization के लिए अनुमति देता है, रोधगलन extracellular मैट्रिक्स (ECM) और उनके जीवविज्ञान गतिविधि के प्रमुख घटकों के संरक्षण । इस प्रोटोकॉल की सिफारिश की जाती है जब मानव कार्डियक ECM संरक्षित ऊतक के साथ-विशिष्ट गैर-गतिविधि कोशिका-मैट्रिक्स बातचीत के प्रायोगिक अध्ययन के लिए आवश्यक है, या जब एक उपयुक्त वातावरण सेल आधारित रोधगलन के दृष्टिकोण के लिए आवश्यक है. सिद्धांत रूप में, यह भी जीएमपी ग्रेड शर्तों के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन संभव है, ताकि प्रोसेस्ड cECM का उपयोग भविष्य चिकित्सीय अनुप्रयोगों में संभव होना चाहिए ।

Protocol

अध्ययन प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा में उल्लिखित नैतिक सिद्धांतों के अनुरूप है और Charité चिकित्सा विश्वविद्यालय की संस्थागत समीक्षा बोर्ड और आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था. सभी रोगियों प्रयोगा?…

Representative Results

मानव मायोकार्डियम के decellularization के लिए 3 कदम प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत सेलुलर सामग्री के पास पूरा हटाने में परिणाम है, जबकि प्रमुख ECM घटकों और ECM के fibrillar संरचना के संरक्षण । decellularization के बाद, ऊतक से कोशि?…

Discussion

जब मानव रोधगलन ECM की तैयारी, लक्ष्य के लिए निंनलिखित को प्राप्त करने के लिए है: प्रासंगिक immunogenic सेलुलर सामग्री के संरक्षण, ECM अखंडता और गैर-सक्रियता, बांझपन, अंत उत्पाद, जीएमपी-प्रक्रिया संगतता की विषाक्तत?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

अध्ययन प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा में उल्लिखित नैतिक सिद्धांतों के अनुरूप है । रोगियों को अनुसंधान प्रयोजनों के लिए ऊतक के उपयोग के लिए सूचित सहमति प्रदान की है, और ऊतक संग्रह की प्रक्रिया संस्थागत समीक्षा बोर्ड और Charité-Universitätsmedizin बर्लिन की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (EA4/028/12) ।

Materials

Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

Riferimenti

  1. Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
  2. Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  4. Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
  5. Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
  6. Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
  7. Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  8. Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
  10. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  11. Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
  12. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  13. Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
  14. Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
  15. Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
  16. Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
  17. Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
  18. Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
  19. Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
  20. Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
  21. Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
  22. Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
  23. Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
  24. Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
check_url/it/56419?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

View Video