Megakaryocyte Differenzierung und Thrombozyten-Formation von Human Cord Blood abgeleitet CD34 Zellen+
Summary
Eine hochreine Bevölkerung von Megakaryozyten erhalten Sie bei Kabel Blut stammenden CD34+ Zellen. Eine Methode für die CD34+ Isolation und Megakaryocyte Zelldifferenzierung wird hier beschrieben.
Abstract
Thrombozyten-Produktion erfolgt hauptsächlich im Knochenmark in einem Prozeß bekannt als Thrombopoiesis. Während Thrombopoiesis differenzieren hämatopoetischen Vorläuferzellen zu Form Thrombozyten Vorläufern genannt Megakaryozyten, die unheilbar unterscheiden, Thrombozyten aus langen zytoplasmatischen Prozesse bezeichnet Proplatelets freizugeben. Megakaryozyten sind seltene Zellen beschränkt sich auf das Knochenmark und sind daher schwer zu ernten, in ausreichender Zahl für den Laboreinsatz. Effiziente Produktion von menschlichen Megakaryozyten kann erreicht in Vitro durch Kultivierung CD34+ Zellen unter geeigneten Bedingungen. Das Protokoll hier detailliert beschreibt Isolierung von CD34+ Zellen durch magnetische Zellen aus Nabelschnurblut Blutproben sortieren. Die notwendigen Schritte um hochreines, Reifen Megakaryozyten serumfreien Bedingungen zu produzieren sind beschrieben. Details der phänotypische Analyse der Megakaryocyte Differenzierung und Bestimmung der proplatelet Bildung und Thrombozyten sind ebenfalls vorhanden. Effektoren, die Megakaryocyte Differenzierung und/oder proplatelet Bildung, wie z. B. Anti-Thrombozyten-Antikörper oder Thrombopoietin Mimetika beeinflussen können hinzugefügt werden kultivierten Zellen, biologische Funktion zu prüfen.
Introduction
Isolierung von ausreichender Anzahl der primären menschlichen Megakaryozyten (MK) für regelmäßige Laboreinsatz ist nicht möglich aufgrund ihrer niedrigen Frequenz im Knochenmark, wo sie ~0.01% von kernhaltigen Zellen1entfallen. Eine bequeme Alternative ist die ex-Vivo -Erweiterung und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen in Anwesenheit von bestimmten Wachstumsfaktoren. Eine Reihe von Zytokinen einschließlich Stammzell-Faktor (SCF; c-Kit-Ligand) und Interleukin (IL)-3 und IL-11 wurden ist in Kultur-Systeme eingesetzt, um MKs Thrombopoietin (TPO) produzieren der effektivste Wachstum und Differenzierung Faktor für Megakaryopoese Kulturen und ist effektiv, allein oder mit anderen Zytokinen, z. B. SCF und IL-3-2. TPO wirken auf Stammzell-Populationen, die Verbreitung und die Reifung der MKs2führen.
MK produzieren Thrombozyten aus zytoplasmatischen Vorsprünge genannt Proplatelets und in-vivo, ca. 1 x 1011 Thrombozyten sind entsteht täglich um Thrombozytenwerte von 150-400 x 109/L. Thrombozyten Produktion in Vitro aufrecht zu erhalten bis zu 1000 -Falten Sie niedriger als die in Vivo 3 schätzt, und dies hat Anlass zu zahlreichen Kulturbedingungen CD34 mit+ hämatopoetischen Vorläuferzellen, MK und Thrombozyten Produktion in Vitrozu verbessern. Die ursprüngliche Quelle der CD34+ für MK Differenzierung verwendete Zellen war menschlichen peripheren Blut4. Andere Zelle Quellen schließen Knochenmark5,6, embryonale Stammzellen/induzierte pluripotente Stammzellen (ESC/iPSC)7und Nabelschnur Blut (UCB)8,9,10 . Menschlichen Knochenmark CD34+ 11 und Maus Linie negative Knochenmark Zellen5 produzieren MK und Blutplättchen in Vitro; Dennoch, die mangelnde Verfügbarkeit von menschlichen Knochenmark schränkt seine Verwendung als eine Quelle von CD34+ Zellen. Im Gegensatz dazu stehen für ESC und iPSC eine unbegrenzte Quelle von Zellen für in-vitro- Thrombozyten-Produktion. Thrombozyten-Produktion aus diesen Zellen erfordert Feeder-Zellen wie murinen OP9 Zellen und längere Kultur. Thrombozyten im Feeder-freien Bedingungen abgeleitet scheinen weniger funktional12sein. iPSC-abgeleitete Plättchen werden voraussichtlich von Einsatz in klinischen Einrichtungen sein, da sie auf einer großen Skala erweitert werden können. Dieser Prozess erfordert Lentivirale vermittelte Transduktion von Transkriptionsfaktoren und langfristige Zelle Kultur13.
UCB ist eine zugängliche Quelle von CD34+ Zellen, die leicht einsetzbare Forschung Einstellungen. TPO allein kann Förderung der Differenzierung der Schnur Blut stammenden CD34+ Zellen, und dies gibt Anlass zu hochreinen, Reife MKs ohne die Notwendigkeit für Serum-Supplementierung oder Kokultur mit Feeder-Zellen. Andere Zytokine wie z. B. SCF Differenzierung von UCB CD34 verringern kann+ Zellen, während Flt-3 Ligand und IL-11 die Produktion von unreifen Megakaryozyten14 fördern. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von hochreinen MK Kulturen aus Nabelschnurblut CD34+ Zellen in serumfreien Bedingungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll eignet sich für konsequente Produktion von MK und Thrombozyten in Kultur aus Nabelschnurblut. Diese Zellen können verwendet werden, um verschiedene Prozesse wie die Wirkung von Drogen oder biologischen Aktivitäten auf MK-Proliferation, Differenzierung, proplatelet Bildung und Produktion der Thrombozyten zu studieren.
Eine Vielzahl von Kultur, Medien und Zytokin-Kombinationen sind in der Literatur vorgestellt worden. Addition von Zytokinen wie Stammzellen Fakt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen die Unterstützung des australischen Gesundheits- und Medical Research Council (Projekt Grant 1012409 verbunden mit BHC).
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
Riferimenti
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