Una popolazione altamente pura dei megacariociti sono ottenibili dal midollo derivate dal sangue CD34+ cellule. Un metodo per CD34+ differenziazione megacariocita e isolamento delle cellule è descritto qui.
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Articolo metodologico
La differenziazione dei megacariociti e formazione delle piastrine da umani cavo emoderivati CD34 cellule+
In questo articolo
Sommario
Abstract
La produzione della piastrina si verifica principalmente nel midollo osseo in un processo noto come thrombopoiesis. Durante thrombopoiesis, cellule progenitrici ematopoietiche differenziano ai precursori delle piastrine forma chiamati megacariociti, che differenziano terminalmente per rilasciare le piastrine da processi citoplasmici lungo definiti associato. I megacariociti sono confinate al midollo osseo le cellule rare e sono quindi difficili da raccogliere in numero sufficiente per uso di laboratorio. Produzione efficiente di megacariociti umani può essere raggiunto in vitro coltivando CD34+ cellule nelle circostanze adatte. Il protocollo dettagliato qui descrive l'isolamento di CD34 cellule di+ da magnetico cella ordinamento da campioni di sangue del cordone ombelicale. Sono descritti i passi necessari per la produzione di megacariociti altamente puri, maturi nelle circostanze senza siero. Dettagli di analisi fenotipica di differenziamento megacariocitico e determinazione della produzione della piastrina e di formazione a disposizione. Gli effettori che influenzano la differenziazione dei megacariociti e/o a formazione, quali gli anticorpi anti-piastrine o mimetics della trombopoietina, possono essere aggiunti alle cellule coltivate per esaminare la funzione biologica.
Introduzione
Isolamento di un numero adeguato di megacariociti umani primari (MK) per uso di laboratorio regolari non è fattibile a causa della loro bassa frequenza nel midollo osseo, dove rappresentano ~0.01% di cellule nucleate1. Una comoda alternativa è l'espansione ex vivo e la differenziazione delle staminali ematopoietiche e cellule progenitrici in presenza di specifici fattori di crescita. Una serie di citochine, compreso il fattore di cellula formativa (SCF; c-kit ligando) e interleuchina (IL) -3 e IL-11 è stati impiegati in sistemi di coltura per produrre MKs. Thrombopoietin (TPO) è il fattore più efficace di crescita e differenziazione me....
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Protocollo
Questo protocollo è stato approvato dal sud orientale Sydney umana ricerca comitato etico e ratificato dal comitato di etica umana ricerca l'Università del New South Wales. Sangue del cordone ombelicale ottenuto da donatori sani è stato fornito da Sydney Cord Blood Bank (Sydney, NSW, Australia). Volumi di circa 100 mL sono stati utilizzati per questa procedura.
Nota: Lavorare in una classe II biosicurezza utilizzando una tecnica asettica. Decontaminare l'esterno della sacca del sangue con etanolo al 70%. Per questa procedura, usare strumenti sterili (forbici, pinzette).
1. cavo di preparazione delle cellule del san....
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Risultati
Questo protocollo permette la preparazione di colture di MK altamente pure dal cordone derivate dal sangue CD34+ cellule. La percentuale di CD34+ cellule nel midollo sangue è di circa 1,3%15 (Figura 1A) e il numero totale di cellule mononucleari (passo 1,8) intervalli da 90-300 x 106 per unità UCB. La purezza di CD34 + cellule CD45 + dopo intervalli di isolamento da 90 a 99% (Figura.......
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Discussione
Il protocollo descritto qui è adatto a produzione costante MK e piastrine in coltura dal sangue del cordone ombelicale. Queste cellule possono essere utilizzate per studiare i vari processi come l'effetto di droghe o di attività biologiche su MK proliferazione, differenziazione, a formazione e produzione della piastrina.
Una varietà di terreni di coltura e combinazioni di citochina sono stati presentati nella letteratura. Addizione di citochine come il fattore di cellula formativa, ligando Flt.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il supporto del Australian Health and Medical Research Council (progetto grant 1012409 collegato a BHC).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti per colture cellulari | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Terreni privi di siero per cellule CD34+ |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagenti di isolamento CD34 | |||
| Kit MicroBead CD34 ultrapuro | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | Questo kit include il reagente bloccante IgG umano FcR e microsfere CD34. Queste perle contengono il clone di anticorpi anti-CD34 QBEND/10. Utilizzare un clone anti-CD34 diverso per il controllo della purezza (ad es. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Terreni di separazione dei linfociti (densità 1,077 g/mL) |
| Tampone di separazione sterile (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | Questo tampone contiene soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,2 contenente lo 0,5% di albumina sierica bovina e 2 mM EDTA. Può essere preparato utilizzando componenti sterili di grado per colture cellulari. Degasare prima dell'uso perché le bolle d'aria possono ostruire la colonna. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Citometria a flusso e reagenti per la colorazione cellulare | |||
| PE Topo anti-umano CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. Questo può essere utilizzato per il controllo della purezza del CD34. Concentrazione finale di anticorpi 1:10 diluizione. |
| PerCP topo anti-umano CD45 | BD Biosciences | 347464 | diluizione 1:10 |
| Controllo dell'isotipo PerCP | BD Biosciences | 349044 | diluizione 1:10 |
| FITC Topo anti-umano CD41a | BD Biosciences | 340929 | Concentrazione finale di anticorpi 1:5 diluizione. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | Questo anticorpo può essere utilizzato anche per rilevare MK maturo (la percentuale di cellule positive è solitamente inferiore rispetto all'anti CD42a). Concentrazione finale di anticorpi 1:10 diluizione. |
| Alexa Fluor 647 Topo anti-Umano CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Attualmente distribuito da Bio-Rad. Concentrazione finale di anticorpi 1:10 diluizione. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Controllo Negativo | AbD Serotec | MCA928A647 | Attualmente distribuito da Bio-Rad. Anticorpo per il controllo dell'isotipo |
| Anti von Willebrand factor coniglio policlonale | Abcam | AB6994 | diluizione 1:200 |
| V450 topo anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | diluizione 1: 20 |
| V450 controllo dell'isotipo | BD Biosciences | 580373 | diluizione 1:20 |
| anticorpo PAC1-FITC | BD Biosciences | 340507 | diluizione 1:10 |
| Anti CD62p topo monoclonale | Abcam | AB6632 | diluizione 1:200 |
| Alexa Fluor 488 capra anti coniglio | IgG Invitrogen | A11008 | diluizione 1:100 |
| Alexa Fluor 594 capra anti topo IgG | Invitrogen | A11020 | diluizione 1:100 |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Anticorpo per il controllo dell'isotipo |
| Ioduro di propidio | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Conteggio delle perline |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS colonne | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Colonne sempre più grandi sono disponibili in commercio |
| Magnete separatore MidiMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL provette FACS in polipropilene a fondo tondo, con tappo a scatto, tecnologie sterili | in vitro | 352063 | |
| vetrini in vetro | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Supporti di montaggio con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mezzo di montaggio antidissolvenza con DAPI |
| strong>Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Equipment | |||
| Microscopio invertito | Microscopio | invertito Leica DMIRB | |
| Microscopio fluorescente | Zeiss | Vert.A1 | |
| Analizzatore cellulare | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuga | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Azienda | Catalog Numero | Comments |
| Software | |||
| Software analizzatore cellulare | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| l'analisi | Tree Star | FlowJo | |
| Software per microscopio fluorescente | Zeiss | Zen 2 blue edition |
Riferimenti
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-m....
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Ristampe e permessi
