En Multimodal Imaging strategi baserad på Micro-CT och fluorescens molekylär tomografi för längsgående bedömning av Bleomycin-inducerad lungfibros hos möss
Summary
Vi beskriver en icke-invasiv multimodal imaging strategi som bygger på Micro-CT och fluorescens molekylär tomografi för längsgående bedömning av lung fibros musmodell induceras av dubbel intratrakeal instillation av bleomycin.
Abstract
Idiopatisk lungfibros (IPF) är en dödlig sjukdom kännetecknas av progressiv och oåterkalleliga förstörelsen av lung arkitektur, som orsakar betydande försämring i lungfunktion och efterföljande dödsfall från andningssvikt.
Patogenesen vid IPF i experimentella djurmodeller har inducerats av bleomycin administration. I denna studie undersöker vi ett IPF-liknande musmodell som induceras av en dubbel intratrakeal bleomycin instillation. Standard histologiska bedömningar används för att studera lungfibros är terminal ingrepp. Målet med detta arbete är att övervaka lungfibros genom noninvasiv avbildningstekniker såsom fluorescerande molekylära tomografi (FMT) och Micro-CT. Dessa två tekniker som valideras med histologi fynd skulle kunna representera en revolutionerande funktionell metod för icke-invasiv realtidsövervakning av IPF sjukdomens svårighetsgrad och förlopp. Fusion av olika tillvägagångssätt representerar ytterligare ett steg för att förstå IPF sjukdomen, där de molekylära händelser som inträffar i ett sjukdomstillstånd kan observeras med FMT och de efterföljande anatomiska förändringarna kan övervakas av mikro-CT.
Introduction
Idiopatisk lungfibros (IPF) är kronisk lungsjukdom med progressiv minskning av lungan fungerar som tyvärr ofta dödlig inom fyra år efter diagnos1. De viktigaste funktionerna i IPF är extracellulär matrix nedfall och fibroblast spridning, men patogenesen är ännu inte helt klarlagt. Den mest stöds hypotesen är att flera cykler av lung skador orsaka förstörelse av alveolära epitelceller som leder till förändring av mesenkymala cellcykeln spridning, överdriven ansamling av fibroblaster och myofibroblaster, och ökad matrix produktion. Medlare som är engagerade i dessa processer såsom matrix metalloproteinaser (MMP) har hittats dysreglerad i fibros utveckling antingen i mänskliga IPF bleomycin-inducerad djurmodeller. Okontrollerad MMP produktionen leder till en obalanserad kollagen nedfall inom lungan interstitium och alveolära utrymme, härma onormal såret reparation1,2.
En av de största hindren för läkemedelsutveckling är tillgången på tillgängliga musmodeller som efterliknar mänsklig patogenes och sjukdom fenotypen. Olika medel har använts för att framkalla lungfibros i djurmodeller: bestrålning skador, administration av asbest och kvarts, administrering av fibrinogenic cytokiner och bleomycin3,4. men bleomycin är mest använda hos möss, råttor, marsvin, hamstrar, kaniner5 eller stora djur (icke-mänskliga primater, hästar, hundar och idisslare)6,7. Bleomycin är ett antibiotikum som gjorts av bakterien Streptomyces verticillus8 och används som en anti-cancer agent9. Lungfibros är en vanlig biverkning av läkemedel och av denna anledning, det används i experimentella djurmodeller för att inducera lungfibros.
Fibrotiska lesioner uppstå i bleomycin-induced lung fibros modeller, 14-21 dagar efter bleomycin administrering. I presenteras arbetet använde vi ett nytt protokoll för att inducera lungfibros hos möss vid dubbel bleomycin intratrakeal instillation. Bleomycin musmodell är mycket tidskrävande eftersom nya läkemedel måste utvärderas på etablerade fibrotiska lesioner och testade för att skilja deras anti fibrotiska effekter från anti-inflammatoriska effekter.
Biokemisk bestämning av kollagen innehåll, morphometrical och histologiska analysen baserades på post mortem analys, begränsa möjligheten att följa patogenesen av sjukdomen i samma djur. Även om dessa parametrar ansågs en guld-standard för fibros utvärdering, de inte ger någon tids- eller rumslig distribution av fibrotiska lesionen och hindra ett sätt att undersöka processen av progression av sjukdomen. 10
Nyligen, icke-invasiv avbildningsteknik har tillämpats på monitor luftvägarna remodeling, inflammation och fibros progression i murina modeller: magnetisk resonanstomografi (MRT), Micro Datortomographyen (Micro-CT), fluorescens molekylär Tomografi (FMT) och självlysande (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Vi föreslår en icke-invasiv tänkbar strategi för att övervaka längdriktningen lung fibros progression av FMT och Micro-CT vid olika tidpunkter efter en bleomycin utmana22.
Många vägar är involverade i upprättandet och utvecklingen av fibros och inte mycket är känt. Endast en djupare förståelse av dessa processer kunde översätta till mer målmolekyler som kan överföra till kliniken. Förmåga att longitudinellt följa MMP aktivering av fluorescens molekylär tomografi kopplat till upptäckt av parenkymal lungförändringar av mikro-CT kan användas i framtiden för åtkomst till det kliniska behandlingssvaret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trots många forskargrupper fokuserar på att utveckla nya läkemedel för behandling av IPF, för tillfället finns bara två tillgängliga för patienter. Det finns ett brådskande medicinska behov att hitta effektivare behandlingar7 eftersom bara lung transplantationis kunna förlänga överlevnaden av 4-5 år26. Den grundläggande förutsättningen för translationell medicin och utveckling av nya läkemedel är tillgången på en djurmodell som efterliknar funktionerna…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr. Daniela Pompilio och Roberta Ciccimarra för teknisk hjälp.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| TrueQuant software | Perkin Elmer Inc. | ||
| Female inbred C57BL/6 | San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX Micro-CT scanner | Perkin Elmer Inc. | ||
| Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus | Sigma | B2434 | |
| Automatic tissue Processor | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| Embedding system | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| Rotary microtome | Slee Cut 6062 | ||
| Digital slide scanner | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR image analysis software | Nikon | ||
| Masson’s Trichrome Staining | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% neutral-buffered formalin | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by scissors |
| Hamilton 0.10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
- Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
- Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
- Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
- Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
- Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
- Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
- Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
- Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
- Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
- Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
- Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
- Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
- Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
- Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , (2011).
- Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
- Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
- King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
- De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).
