En intermodal Imaging tilnærming basert på mikro-CT og fluorescens molekylær tomografi langsgående vurdering av Bleomycin-indusert lunge Fibrosis mus
Summary
Vi beskriver en ikke-invasiv intermodal imaging tilnærming basert på mikro-CT og fluorescens molekylær tomografi langsgående vurdering av musen lunge fibrosis modellen av dobbel intratracheal instillasjon av bleomycin.
Abstract
Idiopatisk lungefibrose (IPF) er en dødelig lungesykdom preget av progressive og irreversibel ødeleggelsen av lunge arkitektur, som forårsaker betydelig forringelse i lungefunksjonen og påfølgende død fra respirasjonssvikt.
Patogenesen av IPF i eksperimentelle dyr modeller har blitt indusert av bleomycin. I denne studien undersøker vi en IPF-lignende musemodell av en dobbel intratracheal bleomycin instillasjon. Standard histologiske vurderinger brukes for å studere lunge fibrosis er invasiv terminal prosedyrer. Målet med dette arbeidet er å overvåke lunge fibrosis gjennom noninvasive Bildeteknikker som fluorescerende molekylær tomografi (FMT) og Micro-CT. Disse to teknologiene validert histology funn kan representere en revolusjonerende funksjonell tilnærming for sanntid ikke-invasiv overvåking av IPF sykdommens alvorlighetsgrad og progresjon. Blanding av ulike tilnærminger representerer et skritt videre forstå IPF sykdommen, der de molekylære hendelsene som forekommer i en patologisk tilstand kan observeres med FMT og påfølgende anatomiske endringene kan overvåkes av mikro-CT.
Introduction
Idiopatisk lungefibrose (IPF) er kronisk lungesykdom med progressiv nedgang lunge funksjoner som dessverre ofte fatal innen fire år diagnose1. Hovedfunksjonene til IPF er ekstracellulær matrix avsettelse og fibroblast spredning, men patogenesen er ennå ikke fullt ut forstått. Mest støttede hypotesen er at flere sykluser av lunge skader forårsake ødeleggelse av alveolar epitelceller som fører til endring av mesenchymal celle syklus spredning, overdreven akkumulering av fibroblaster og myofibroblasts, og økt matrix produksjon. Meglere involvert i disse prosessene matrise metalloproteinases (MMPs) har blitt funnet dysregulated fibrose utvikling i menneskelig IPF eller bleomycin-indusert dyremodeller. Ukontrollert MMP produksjon fører til en ubalansert avleiring av kollagen i lunge interstitium og alveolar plass, etterligne unormal såret reparasjon1,2.
En av de viktigste hindringene for medisiner og utvikling er tilgjengeligheten av tilgjengelig musen modeller som etterligner menneskelige patogenese og sykdom fenotypen. Forskjellige agenter har blitt brukt til å indusere lunge fibrosis dyremodeller: bestråling skade, administrasjon av asbest og silika, administrasjon av fibrinogenic cytokiner og bleomycin3,4; men bleomycin er mest brukte i mus, rotter, guinea pigs, hamsters, kanin5 eller i store dyr (ikke-menneskelige primater, hester, hunder og drøvtyggere)6,7. Bleomycin er en antibiotikaresistens laget av bakterien Streptomyces verticillus8 og brukes som en anti-kreft agent9. Lungefibrose er en vanlig side bevirke av stoffet og av denne grunn, det er brukt i eksperimentell dyremodeller for å indusere lungefibrose.
I bleomycin-indusert lunge fibrosis modeller forekommer fibrotiske lesjoner 14-21 dager etter bleomycin administrasjon. I presentert arbeidet brukte vi en ny protokoll for å indusere lunge fibrosis mus av dobbel bleomycin intratracheal instillasjon. Bleomycin musemodell er tidkrevende fordi nye stoffer må vurderes på etablerte fibrotiske lesjoner, og testet for å skille sin anti-fibrotiske effekter fra anti-inflammatoriske effekter.
Biokjemiske fastsettelse av kollagen innhold, morphometrical og histologiske analyse var basert på post mortem analyse, begrense muligheten til å følge patogenesen av sykdommen i samme dyret. Selv om disse parameterne ble betraktet som en gull-standard for fibrose evaluering, de ikke gir alle timelige eller romlige fordelingen av fibrotiske lesjonen og utelukke en måte å undersøke prosessen av sykdomsprogresjon. 10
Nylig, ikke-invasiv bildeteknologi er brukt på skjermen airway remodeling, betennelser og fibrose progresjon i murine modeller: magnetisk resonans Imaging (MRI), Micro konstatere (mikro-CT), fluorescens molekylær Tomografi (FMT) og Bioluminescent (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Vi foreslår en ikke-invasiv tenkelig tilnærming for å overvåke langs lunge fibrosis progresjon av FMT og mikro-CT på ulike tidspunkt etter en bleomycin utfordrer22.
Mange baner er involvert i etablering og utvikling av fibrosis, og ikke mye er kjent. Bare en dypere forståelse av disse prosessene kan oversette til mer narkotika mål som kan overføre til klinikken. Evnen å dataskjerm langs MMP aktivisering av fluorescens molekylær tomografi kombinert til deteksjon av lungekreft parenchymal endringer av mikro-CT kan brukes i fremtiden til klinisk respons på behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til tross for mange forskningsmiljø fokuserer på å utvikle nye medisiner til å behandle IPF, i øyeblikket er bare to tilgjengelig for pasienter. Det er en medisinsk haster å finne mer effektive behandlinger7 fordi bare lunge transplantationis kunne forlenge overlevelsen av 4-5 år26. En viktig forutsetning for translasjonsforskning medisin og utvikling av nye stoffer er tilgjengeligheten av en dyremodell som etterligner funksjonene IPF og hvor intervensjonsradiologi s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Dr. Daniela Pompilio og Roberta Ciccimarra for teknisk hjelp.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| TrueQuant software | Perkin Elmer Inc. | ||
| Female inbred C57BL/6 | San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX Micro-CT scanner | Perkin Elmer Inc. | ||
| Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus | Sigma | B2434 | |
| Automatic tissue Processor | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| Embedding system | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| Rotary microtome | Slee Cut 6062 | ||
| Digital slide scanner | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR image analysis software | Nikon | ||
| Masson’s Trichrome Staining | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% neutral-buffered formalin | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by scissors |
| Hamilton 0.10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
- Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
- Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
- Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
- Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
- Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
- Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
- Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
- Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
- Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
- Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
- Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
- Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
- Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
- Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , (2011).
- Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
- Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
- King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
- De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).
