Med Dot-analys att analysera Migration av Cell ark
Summary
Cellmigration är avgörande för utveckling, vävnad underhåll och reparation och uppkomst, och regleras av cytokiner, tillväxtfaktorer och chemokiner. Det här protokollet beskriver dot analysen, en tvådimensionell, obegränsad invandring analysen att bedöma flyttande fenotypen av bifogade, sammanhängande cell ark som svar på microenvironmental signaler.
Abstract
Komplexa organismer tyckas statisk, är deras vävnader under en kontinuerlig omsättning. Som cellerna ålder, flytta dö, och är ersatt av nya celler, celler inom vävnader i ett tätt iscensatt sätt. Denna balans störs under tumörutveckling, och tumörceller lämnar epitelet i ursprung att invadera den lokala mikromiljö, att resa till avlägsna platser, och att slutligen bilda metastaserande tumörer på avlägsna platser. Dot analysen är en enkel, tvådimensionell unconstrained migration analys, att bedöma den netto rörelsen cell ark i en cell-fritt område och analysera parametrar av cellmigration med time-lapse imaging. Här, dot analysen påvisas med en mänskliga invasiva, lung kolonibildande breast cancer cellinje, MCF10CA1a, för att analysera cellernas flyttande svar på epidermal tillväxtfaktor (EGF), som är känt för att öka malign potential av bröstcancer cancerceller och att ändra flyttande fenotypen av celler.
Introduction
Migration-analyser används ofta för att utvärdera den invasiva och metastatisk potentialen av tumör celler in vitro. Vanligast, används det såret eller scratch test för att bedöma migration av epitelial ark till en cell som rensat området1,2,3. För att utföra scratch analysen, celler är klädd i en enskiktslager och en ”repa” eller cell-fritt område skapas med en pipettspetsen. Scratch analysen är lätt att ställa upp med allmänt tillgängliga vävnadsodling leveranser och kan utföras i plattor med flera, vilket möjliggör bearbetning av flera prover. Dock som scratch görs, celler avlägsnas fysiskt från enskiktslager och genomgår ofta celldöd. Extracellulär matrix kopplad till plattan är dessutom ofta skadad under processen avlysningen. Likaså användningen av kisel infogas (t.ex. Ibidi kammare4) eller av stenciler5,6,7 kan leda till mekaniska avbrott i cellerna och partiellt avlägsnande av matrix proteiner används för beläggning av plattorna. En annan nackdel med analyser övervakning nedläggning av sår eller repor är sin begränsade tid kurs, som cellmigration kan endast analyseras tills scratch är stängd.
I utför dot analysen, är celler klädd som en cirkulär koloni på ett bestruket eller obestruket tallrik8. Grunden för denna plätering strategi är att få cell ark med definierade kanter, som kan migrera eller invadera in i omgivande cellfria områden utan att störa kulturen av borttagning av celler eller skär. Det övergripande målet för dot analysen är att observera migration av cell ark mätt som edge förskjutning eller kolonin diameter, samt att utföra time-lapse imaging att analysera flyttande fenotypen av celler i högre plats-temporal upplösning.
Cellmigration kan påverkas av en mängd microenvironmental ledtrådar som chemokiner, cytokiner och tillväxtfaktorer såsom EGF. EGF är en tillväxtfaktor som utövar sin biologiska effekt genom bindning till sin receptor, EGF-receptorn9, och ökar invasiva och metastaserande beteende av tumör celler4,9,10. Här dot analysen används att studera EGF stimuleras cellmigration i en mänsklig invasiva, lung kolonibildande breast cancer cell linje (MCF10CA1a)8,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migrera från vävnaden i ursprung att invadera den omgivande vävnaden och metastasera till avlägsna platser15under progression tumörceller. Migrering av celler från en cell koloni kan observeras i dot-analysen. Här illustreras dot analysen genom att analysera flyttande fenotypen av mänskliga bröstcancerceller svar på EGF.
För att erhålla exakta och reproducerbara resultat flera steg i utformningen av dot är analyserna kritisk. Först, beläggning av plattan …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författaren vill tacka Bhagawat Subramanian, Yi (Jason) Chang, Paul Randazzo, och Carole Parent för att läsa och kommentera manuskriptet. Detta arbete stöds av intramurala forskningsprogrammet av National Cancer Institute, National Institutes of Health.
Materials
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for asay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| LPA (1-Oleoyl Lysophosphatidic Acid ) | Cayman | 10093 | used to stimulate cells |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for LPA and EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
Riferimenti
- Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8 (3), 58859 (2013).
- Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).
- Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
- Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5 (3), 9832 (2010).
- Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366 (1), 2-16 (2006).
- Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O’Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501 (2013).
- Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).
- Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).
- Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).
- Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15 (2), (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).
- Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).
