Методы для изучения изменений в присущих агрегации белков с возрастом у нематоды Caenorhabditis elegans
Summary
Цель метода, представленные здесь заключается в изучении агрегации белков во время нормального старения в организме модель C. elegans. Протокол представляет собой мощный инструмент для изучения весьма нерастворимых большие компоситы, которые формируют с возрастом и определить, как изменения в proteostasis воздействия агрегации белков.
Abstract
В последние десятилетия распространенность нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера (AD) и болезнь Паркинсона (PD), выросла. Эти расстройства, связанные с возрастом характерно появление белка агрегатов с фибриллово структурой в мозгах у этих больных. Почему именно обычно растворимые белки проходят процесс агрегации по-прежнему осознаются. Открытие, что агрегации белков не ограничивается процессов болезни и вместо этого частью нормального процесса старения включает изучение молекулярных и клеточных механизмов, которые регулируют агрегации белков, без использования ectopically выразил человека болезни связанных белков. Здесь мы описываем методологии для изучения присущих белка агрегации в Caenorhabditis elegans через взаимодополняющих подходов. Во-первых мы изучим как выращивать большое количество синхронизированы возраст C. elegans для получения возрасте животные и мы представляем биохимическими процедурами изолировать высоко нерастворимые большие компоситы. В сочетании с целенаправленной генетических нокдаун, это позволяет вскрыть роль гена интереса к содействию или предотвращения агрегации белков зависит от возраста с количественного масс-спектрометрии с помощью либо всеобъемлющий анализ или кандидат-анализа на основе с антителами. Затем эти выводы подтверждаются в естественных условиях анализа с трансгенных животных, выражая люминесцентной меткой подверженных агрегации белков. Эти методы должны помочь разъяснить, почему некоторые белки склонны к совокупности с возрастом и, в конечном итоге, как сохранить эти белки полностью функциональной.
Introduction
Сворачиванию белков и агрегации признаются в качестве отличительной чертой нескольких нейродегенеративных заболеваний, таких как AD, PD, боковой амиотрофический склероз (ALS), frontotemporal деменции (FTD) и многие другие. К примеру α-synuclein сборок в амилоидных фибрилл, накапливаться Леви органов, особенно в Substantia PD больных, в то время как в ALS пациентов TDP-43 или Фу misfold к форме цитоплазматических агрегатов в вырождающихся двигательных нейронов. В каждом из этих нейродегенеративных расстройств механизмы поддержания гомеостаза белка или proteostasis не сможем предотвратить накопление смятых протеинов, следовательно, приводит к болезни.
Proteostasis имеет решающее значение для обеспечения клеточных функций, и в нормальных условиях эти механизмы регулирования плотно контролировать скорость синтеза белка, складные и деградации. Несколько исследований показывают, что с возрастом, постепенно нарушается способность многих клеток и органов сохранить гомеостаз белка и физиологические ухудшение proteostasis сетей с возрастом является важным фактором, усугубляющим нейродегенеративные заболевания (Обзор ссылки1,2,3). Тот факт, что контроль качества белков и клеточного ответа на стресс развернулось белка затрудняется с возрастом свидетельствует о том, что общим следствием старения может быть сворачиванию белков и агрегации. Действительно мы и другие показали, что агрегации белков не ограничивается болезни и вместо этого частью протеома становится весьма моющих средств нерастворимые в возрасте животных4,5,6,7 ,8,9,10. Вычислительные и в естественных условиях анализ показал, что эти физиологических возрастных агрегаты напоминают болезни агрегатов в нескольких аспектах5. Открытие эндогенные, возраст зависимых белков агрегации дает нам возможность вскрыть молекулярных и клеточных механизмов, которые регулируют агрегации белков, без использования ectopically выраженной человеческие белки, связанных заболеваний. В настоящее время о регулировании нерастворимость широко белка и о последствиях этой регуляции на состояние здоровья организма существует лишь ограниченная информация.
Нематоды C. elegans является одним из наиболее подробно изученных модельных организмов в процессе старения исследований, как эти животные имеют относительно короткий срок и показать многие черты характерные старения, наблюдается в высших организмов. Последствия старения на белок нерастворимость в C. elegans , изучен последовательных биохимических фракционирования, на основе дифференциальных растворимость, который широко используется для извлечения болезни агрегатов в области исследований нейродегенеративные11 . Путем количественного масс-спектрометрии стать агрегации подверженных в C. elegans в отсутствие болезни5были показаны несколько сотен белков. Здесь мы подробно описать протокол выращивать большое количество червей в жидкой культуры и последовательное извлечение изолировать агрегированных белков для количественного определения масс-спектрометрии и анализа, Западная помарка. Потому что Протеолиз и подверженных агрегации белков накапливается в возрасте C. elegans гонад и маски изменения в другие соматические ткани5,12,13, мы используем Гонада менее мутант сосредоточиться анализ на белок нерастворимость в не репродуктивных тканях. Представлен метод позволяет анализ высоко нерастворимые, крупных агрегатов, которые нерастворимы в 0,5% SDS и гранулированных относительно низкой скоростью центробежные. Кроме того, был менее строгие протокол извлечения для сбора также меньшие и более растворимые агрегатов опубликованы в другом месте10. Кроме того мы описываем метод, используемый для оценки агрегации в естественных условиях в C. elegans.
В целом эти методы в сочетании с РНК-интерференции (RNAi) можно оценить роль гена интереса к модуляции агрегации белков зависит от возраста. Для этого мы описываем анализ выдержек из молодых и пожилых червей с и без нокдаун специфического протеина интереса, с помощью РНК-интерференции. Эти методы должны быть мощным инструментом, чтобы определить, какие компоненты сети proteostasis регулировать нерастворимость белка. Несколько мероприятий таких как снижение инсулина/инсулин подобный фактор роста (IGF) 1 сигнализации (IIS) показали значительно отсрочить старение C. elegans 14. Долголетие пути часто вызывают механизмов контроля качества протеина и таким образом эти пути могут активно влияющие на уровень агрегации белков. В качестве примера мы демонстрируем снижение присущие белка агрегации в долгоживущих животных при торможении путь IIS7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы приводим методологию для изоляции агрегатов высоко нерастворимого белка от старения C. elegans подвергается РНК-интерференции для анализа по масс-спектрометрии и Западный blotting. Мы покажем, что улучшение proteostasis путем уменьшения IIS значительно препятствует агрегации белков за…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансирование от DZNE и Мари Кюри международной реинтеграции Грант (322120 D.C.D.)
Materials
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
- Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
- Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
- Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
- Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
- Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
- Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
- Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
- Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
- Sulston, J. H. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
- Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
- Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
- Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
- Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
- Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
- Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
- Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).
