Méthodes d’étude des changements dans l’agrégation des protéines inhérente avec l’âge chez Caenorhabditis elegans
Summary
L’objectif de la méthode présentée ici est d’explorer l’agrégation des protéines au cours du vieillissement normal dans l’organisme modèle c. elegans. Le protocole représente un outil puissant pour étudier les grands agrégats fortement insolubles qui se forment avec l’âge et de déterminer comment la modification des protéostasie sur l’agrégation protéique.
Abstract
Au cours des dernières décennies, la prévalence des maladies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer (ma) et la maladie de Parkinson (MP), s’est développée. Ces troubles associés âge sont caractérisent par l’apparition d’agrégats de protéines avec la structure fibrillaire dans le cerveau de ces patients. Exactement pourquoi les protéines solubles normalement subissent un processus d’agrégation reste mal compris. La découverte que l’agrégation des protéines n’est pas limitée aux processus morbides et plutôt partie du processus normal de vieillissement permet l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent l’agrégation des protéines, sans utiliser de façon ectopique exprimé humaine protéines associées à la maladie. Nous décrivons ici les méthodologies afin d’examiner l’agrégation des protéines inhérente chez Caenorhabditis elegans au moyen d’approches complémentaires. Tout d’abord, nous examinons comment faire pousser un grand nombre d’âge synchronisé c. elegans afin d’obtenir des animaux âgés et nous présentons les processus biochimiques pour isoler fortement-insoluble-gros agrégats. En combinaison avec un knockdown génétique ciblée, il est possible de disséquer le rôle d’un gène d’intérêt dans la promotion ou de prévenir l’agrégation des protéines de la fonction de l’âge en utilisant soit une analyse complète avec la spectrométrie de masse quantitative ou un analyse axée sur les candidats avec des anticorps. Ces observations sont ensuite confirmées par in vivo analyse avec des animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes sujettes à l’agrégation. Ces méthodes devraient aider à clarifier pourquoi certaines protéines sont enclins à l’agrégat avec l’âge et, en définitive, comment garder ces protéines entièrement fonctionnel.
Introduction
Repliement et agrégation sont reconnus comme une caractéristique de plusieurs maladies neurodégénératives comme la publicité, PD, sclérose latérale amyotrophique (SLA), démence fronto-temporale (DFT) et bien d’autres. Par exemple, α-synucléine assemblées en fibrilles amyloïdes qui s’accumulent dans le corps de Lewy en particulier dans la substantia nigra de patients Parkinsoniens, tandis qu’en ALS patients TDP-43 ou FUS repliement pour former des agrégats cytoplasmiques dans la dégénérescence des neurones moteurs. Dans chacune de ces maladies neurodégénératives, mécanismes de maintenir l’homéostasie des protéines ou protéostasie ne parviennent pas à empêcher l’accumulation de protéines mal repliées, par conséquent conduisant à la maladie.
Protéostasie est essentiel pour assurer les fonctions cellulaires et dans des conditions normales, ces mécanismes de réglementation contrôlent étroitement le taux de synthèse des protéines, pliage et de dégradation. Plusieurs études démontrent qu’avec le vieillissement, la possibilité de nombreuses cellules et organes à préserver l’homéostasie des protéines est peu à peu et la détérioration physiologique des réseaux protéostasie avec l’âge est un facteur aggravant important pour maladies neurodégénératives (révisés dans les références1,2,3). Le fait que le contrôle de qualité de protéine et la réponse cellulaire au stress de la protéine dépliée sont compromises avec l’âge suggère que le repliement et l’agrégation pourraient être une conséquence générale du vieillissement. En effet, nous et autres avons démontré que l’agrégation des protéines n’est pas limitée à la maladie et plutôt partie du protéome devient hautement détergent insoluble dans animaux âgés4,5,6,7 ,8,9,10. Computational et in vivo l’analyse a révélé que ces agrégats physiologiques liées au vieillissement ressemblent à des agrégats de la maladie dans plusieurs aspects5. La découverte de l’agrégation des protéines endogènes, fonction de l’âge nous donne l’occasion de disséquer les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent l’agrégation des protéines, sans utiliser les protéines humaines exprimées de façon ectopique associés à la maladie. À l’heure actuelle, il existe que peu d’informations sur la régulation de l’insolubilité de la protéine généralisée et sur les effets de ce dérèglement sur la santé de l’organisme.
Le nématode c. elegans est un des organismes plus étudiés de modèle au cours du vieillissement recherche car ces animaux ont une durée de vie relativement courte et présenter de nombreuses caractéristiques de vieillissement caractéristique observées chez les organismes supérieurs. Les effets du vieillissement sur l’insolubilité de la protéine ont été étudiés chez c. elegans par fractionnement biochimique séquentiel, basé sur la solubilité différentielle, qui est largement utilisée pour extraire des agrégats de la maladie dans le domaine de la recherche de neurodégénérescence11 . Par spectrométrie de masse quantitative, plusieurs centaines protéines se sont révélés devenir agrégation sujettes chez c. elegans en l’absence de maladie5. Ici, nous décrivons en détail le protocole afin de cultiver un grand nombre de vers dans le milieu de culture liquide et l’extraction séquentielle pour isoler les protéines agrégées pour la quantification par spectrométrie de masse et analyse par Western blot. Parce que les protéines mal repliées et sujette à l’agrégation s’accumulent dans les personnes âgées c. elegans gonades et masques des changements dans les autres tissus somatiques5,12,13, nous utilisons un mutant de gonades-moins pour axer l’analyse sur les protéines insolubilité dans les tissus non reproductrices. La méthode présentée permet l’analyse des agrégats hautement insoluble, grandes qui sont insolubles dans 0,5 % SDS et granulés de vitesse centrifuge relativement faible. Par ailleurs, un protocole d’extraction moins strict de recueillir également des agrégats plus petits et plus solubles a été publié ailleurs10. En outre, nous décrire la méthode utilisée pour évaluer l’agrégation in vivo chez c. elegans.
Dans l’ensemble, ces méthodes en combinaison avec l’interférence ARN (ARNi) peuvent évaluer le rôle d’un gène d’intérêt dans la modulation de l’agrégation protéique de la fonction de l’âge. Pour cela, nous décrivons l’analyse d’extraits de jeunes et âgés vers avec et sans précipitation d’une protéine spécifique d’intérêt utilisant l’ARNi. Ces méthodes doivent être un outil puissant pour déterminer quels composants du réseau protéostasie réglementent insolubilité de la protéine. Plusieurs interventions réduites telles que l’insuline/insuline-like growth factor (IGF) 1 signalisation (IIS) auraient dû être divulgués de retarder considérablement c. elegans vieillissement14. Voies de longévité souvent induisent des mécanismes de contrôle de la qualité des protéines et donc ces voies pourraient être activement qui influent sur le taux d’agrégation de la protéine. Ainsi, nous démontrons l’agrégation de la protéine intrinsèque réduite chez les animaux de longue durée sur l’inhibition de la voie IIS7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons une méthode pour isoler les agrégats de protéines hautement insoluble c. elegans soumis à Arni pour l’analyse par spectrométrie de masse et les éponger occidental de vieillissement. Nous montrons qu’améliorer protéostasie en réduisant considérablement les IIS empêche l’agrégation des protéines de la fonction de l’âge. En sélectionnant des protéines spécifiques sujettes à l’agrégation de surexprimer chez c. elegans, il est possible de disséquer davantage les…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la DZNE et une subvention de réintégration Marie Curie International (322120 à D.C.D.)
Materials
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
References
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