Metoder for å studere endringer i iboende Protein samling med alder i Caenorhabditis elegans

Summary

Målet med metoden som presenteres her er å utforske protein aggregering under normal aldring i modellen organismen C. elegans. Protokollen representerer et kraftig verktøy til å studere de svært uløselig store aggregatene som danner med alderen og bestemme hvordan endringer i proteostasis påvirker protein aggregering.

Abstract

I de siste tiårene, har utbredelsen av nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom (AD) og Parkinsons sykdom (PD), vokst. Disse alder-tilknyttede lidelser er preget av utseendet på protein aggregat med fibrillary strukturen i hjernen til disse pasientene. Nøyaktig hvorfor vanligvis løselige proteiner gjennomgå fortsatt en samling prosessen dårlig forstått. Oppdagelsen at protein samling er ikke begrenset til sykdom prosesser og en del av normal aldringsprosessen kan stedet studere molekylære og cellulære mekanismer som regulerer protein aggregering, uten å bruke ectopically uttrykt menneskelige sykdomsassosierte proteiner. Her beskriver vi metoder for å undersøke iboende protein samling i Caenorhabditis elegans gjennom supplerende tiltak. Først vi undersøker hvordan å vokse stort antall alder-synkroniserte C. elegans hente alderen dyr og presenterer vi de biokjemiske fremgangsmåtene for å isolere svært uløselig-store mengder. I kombinasjon med en målrettet genetisk knockdown, er det mulig å dissekere rollen en genet av interesse i å fremme eller forebygge alder-avhengige proteiner aggregering ved hjelp av enten en omfattende analyse med kvantitative massespektrometri eller kandidat-basert analyse med antistoffer. Disse funnene er deretter bekreftet av i vivo analyse med transgene dyr uttrykke fluorescerende-merket samling utsatt proteiner. Disse metodene bør klargjøre hvorfor visse proteiner er utsatt for samlet med alder og til slutt hvordan beholde disse proteinene funksjonell.

Introduction

Protein misfolding og aggregering gjenkjennes som et kjennetegn på flere nevrodegenerative sykdommer som Annonsen, PD, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal-demens (FTD) og mange andre. For eksempel α-synuclein samlinger i amyloid fibrils som akkumuleres som Lewy-legemer i substantia nigra PD pasienter, mens i ALS pasienter TDP-43 eller Fu misfold til skjemaet cytoplasmatiske aggregat i degenereres motor neurons. I hver av disse nevrodegenerative lidelser mislykkes mekanismer opprettholde protein homeostase eller proteostasis å hindre akkumulering av misfolded proteiner, derfor fører til sykdom.

Proteostasis er avgjørende for å sikre cellulære funksjoner under normale forhold disse regulatoriske mekanismene kontroll tett frekvensen av proteinsyntese, bretting og fornedrelse. Flere studier viser at med aldring, evne til mange cellene og organene å bevare protein homeostase settes gradvis og fysiologiske forverring av proteostasis nettverk med alderen er en viktig skjerpende faktor for nevrodegenerative sykdommer (omtalt i referanser^1,2,3). Det faktum at protein kvalitetskontroll og cellulær respons på brettet protein stress er utsatt med alderen antyder at protein misfolding og aggregering kan være en generell konsekvens av aldring. Faktisk har vi og andre vist at protein samling er ikke begrenset til sykdom og i stedet en del av proteom blir svært vaskemiddel-uløselig i alderen dyr^{4,5,6,7 ,8,9,10}. Beregningsorientert og i vivo analyse viste at disse fysiologiske aldersrelatert aggregater ligner sykdom mengdefunksjoner i flere aspekter⁵. Oppdagelsen av endogen, alder avhengig av protein aggregering gir oss muligheten til å analysere molekylære og cellulære mekanismer som regulerer protein aggregering, uten å bruke ectopically uttrykt menneskelige sykdomsassosierte proteiner. I dag finnes begrenset informasjon om regulering av utbredt protein insolubility og effekten av denne feilregulering på helsen til organismen.

Rundormer C. elegans er en av de mest omfattende studerte modell organismene i aldring forskning som disse dyrene har en relativt korte levetid og viser mange karakteristiske aldring funksjoner i høyere organismer. Effektene av aldring på protein insolubility har vært studert i C. elegans av sekvensiell biokjemiske fraksjoneres basert på differensial løselighet, som er mye brukt til å trekke ut sykdom aggregater innen neurodegeneration forskning¹¹ . Ved kvantitative massespektrometri, ble mange hundre proteiner vist å bli aggregering utsatt i C. elegans i fravær av sykdom⁵. Her beskrive vi i detalj protokollen for å vokse stort antall ormer i flytende kultur og sekvensiell utvinning isolere aggregert proteiner for kvantifisering av massespektrometri og analyse ved Western blot. Fordi misfolded og aggregering utsatt proteiner akkumuleres i alderen C. elegans gonader og masker endringer i andre somatiske vev^5,12,13, vi bruker en gonad-mindre mutant fokusere analyse på protein insolubility i ikke-reproduktiv vev. Metoden presentert kan analyse av svært-uløselig, stor Sammendrag som er uløselig i 0,5% SDS og pelleted ved relativt lav sentrifugal hastighet. Alternativt en mindre strenge utvinning protokoll samle også mindre og mer løselig aggregater har vært publisert andre steder,¹⁰. I tillegg beskriver vi metoden brukes til å vurdere aggregering i vivo i C. elegans.

Samlet kan disse metodene sammen med RNA-interferens (RNAi) vurdere rollen en genet av interesse modulerende alder-avhengige proteiner aggregering. For dette beskrive vi analyse av ekstrakter fra ung og gammel ormer med og uten knockdown av et bestemt protein rundt ved hjelp av RNAi. Disse metodene bør være et kraftig verktøy for å finne ut hvilke komponenter av proteostasis nettverket regulere protein insolubility. Flere tiltak som redusert insulin/insulin-lignende vekstfaktor (IGF) 1 signalering (IIS) har vist seg å forsinke dramatisk C. elegans aldring¹⁴. Levetid veier indusere ofte protein kvalitet kontrollmekanismer og dermed disse veiene kan være aktivt påvirke hastigheten av protein aggregering. Som et eksempel viser vi redusert iboende protein samling i varige dyr på hemming av IIS veien⁷.

Protocol

Merk: For en bedre forståelse av prosedyren, en skjematisk av arbeidsflyten (figur 1) er festet. 1. vekst av store tall for unge og eldre C. elegans utsatt RNAi mot et genet av interesse Merk: Bruk C. elegans temperatur-indusert sterilt gon-2(q388) mutanter (CF2253) å få alderen-synkroniserte folkerike. I alle trinnene er det viktig å arbeide under semi sterile forhold med åpen flamme og kontroller at det f…

Representative Results

Vi brukte metodene presenteres her for å evaluere hvordan varige dyr med redusert IIS modulerer alder-avhengige proteiner aggregering. Western blot (se trinn 2.2, hastig uløselig protein utvinning for Western blot analyse), vi analysert totalt og uløselig proteininnhold av unge (dag 3 av voksen) og alderen (dag 18 voksen) ormer kontroll RNAi og på RNAi målretting insulin / IGF-1-lignende reseptor daf-2. Vi observerte ingen store endringer i totalt protein nivå med alder ell…

Discussion

Her rapporterer vi en metode for å isolere svært-uløselig protein aggregater fra aldring C. elegans utsatt for RNAi for analyse av massespektrometri og vestlige blotting. Vi viser at forbedre proteostasis ved å redusere IIS sterkt hindrer alder-avhengige proteiner aggregering. Ved å velge bestemte aggregering utsatt proteiner til overexpress i C. elegans, er det mulig å analysere videre mekanismer modulerende iboende protein aggregering.

Iboende alder-avhengige …

Materials

Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1088655	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	300635
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	04716728001	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	09830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4352135	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	393126
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	393315
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5404000413
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702000329
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	75004518
Concentrator Plus	Eppendorf	5305000304	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158		Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]