Indução e Micro-CT Imaging de malformações cavernosas cerebrais no modelo de Mouse
Summary
Este protocolo demonstra a indução da doença malformação cavernosa cerebral em um modelo do rato e usa contraste aprimorado micro computadorizada para medir carga de lesão. Esse método aumenta o valor dos modelos de rato estabelecida para estudar a base molecular e terapias potenciais para malformação cavernosa cerebral e outras doenças cerebrovasculares.
Abstract
Mutações no CCM1 (aka KRIT1), CCM2, ou CCM3 (aka PDCD10) gene causar malformação cavernosa cerebral (CCM) em seres humanos. Modelos do rato da doença CCM foram estabelecidos pela exclusão de tamoxifeno induzido de Ccm genes em animais pós-natal. Esses modelos de rato fornecem ferramentas de valor inestimáveis para investigar o mecanismo molecular e abordagens terapêuticas para a doença CCM. Um método exato e quantitativo para avaliar a progressão e o fardo da lesão é essencial para aproveitar o valor total desses modelos animais. Aqui, demonstramos a indução da doença do CCM em um modelo do rato e o uso do contraste melhorado método de (micro-CT) radiografia computadorizada micro medida CCM encargo de lesão no cérebro de rato. No dia pós-natal 1 (P1), usamos 4-hydroxytamoxifen (4HT) para ativar a atividade de recombinase Cre do transgene de Cdh5-CreErt2 para decompor o alelo floxed de Ccm2. Lesões do CCM em cérebro de rato foram analisadas em P8. Para o micro-CT, solução de Lugol à base de iodo foi usada para aumentar o contraste no tecido cerebral. Nós temos otimizado os parâmetros de verificação e utilizou uma dimensão de voxel de 9,5 µm, que levam a um tamanho mínimo de recurso de aproximadamente 25 µm. Esta resolução é suficiente para medir o número e volume de lesão CCM globalmente e com precisão e fornecer alta qualidade 3D mapeamento de lesões do CCM em cérebro de rato. Esse método aumenta o valor dos modelos rato estabelecida para estudar as bases moleculares e terapias potenciais para CCM e outras doenças cerebrovasculares.
Introduction
CCM são de paredes finas, dilatado malformações vasculares no cérebro, com prevalência de até 0,5% na população humana1. CCM pode ser herdada como uma desordem dominante devido a mutações de perda de função em um dos três genes: CCM1 (aka Krit1), CCM2e CCM3 (também chamado PDCD10)2,3,4 ,5,6. Estes genes estão presentes em um único complexo de sinalização.
Foram desenvolvidos vários modelos para doenças humanas de CCM modelo e entender os caminhos a jusante de genes CCM que são responsáveis por CCM7,8,9,10. O modelo mais robusto é condicionalmente excluir qualquer um dos genes Ccm com tamoxifeno-inducible Cdh5-CreERT2 em P1 em filhotes recém-nascidos8,10. Esses filhotes desenvolvem lesões CCM no cérebro de P6 para a frente e são esperados para ser um modelo ideal para estudos pré-clínicos em busca de mecanismos e agentes terapêuticos no tratamento de doenças do CCM.
Fardo de lesão CCM em cérebro de rato foi medido principalmente pelos métodos baseados em histologia, uma abordagem que é extremamente demorado e sujeito a investigador viés de11,10,12. MRI com base em métodos foram usados para avaliar a carga de lesão CCM no rato adulto modelo9,13. No entanto, um instrumento de MRI animal pequeno altamente especializado e varredura-tempo de várias horas durante a noite é necessária para alcançar uma resolução satisfatória para identificar lesões CCM. Também, não foi relatada se ressonância magnética pode ser usada para detectar lesões do CCM em camundongos Neonatais e resolução pode limitar a sensibilidade.
Recentemente desenvolvemos uma técnica de micro-CT para imagem e analisar CCM lesão14,15. De alta resolução, tempo e método cost-effective dramaticamente impulsionaram o valor do modelo de doença CCM em estudos terapêuticos e mecanicistas. Melhorar o contraste, toda montagem coloração métodos têm sido utilizados para a imagem latente de micro-CT dos tecidos moles e rato embriões16,17. Anteriormente, usamos uma baseada no ósmio de coloração para realçar o contraste para a imagem latente de micro-CT de lesões do CCM no cérebro14. Neste trabalho, usamos um menos tóxico, não-destrutivo, e reagente custo-eficiente, um iodo solução baseada em solução de Lugol, para realçar o contraste para a imagem latente de micro-CT. Iodo pode difundir em todo o cérebro e tem uma elevada afinidade para sangue18.
O protocolo detalhado é apresentado aqui para a indução de lesões do CCM em um modelo de rato neonatal, junto com a imagem e análise de lesões CCM com uma contraste baseados micro-CT. Este método baseado em micro-CT fornece medição global quantitativa do volume de lesão do CCM, identifica com precisão o número e a localização em 3D das lesões do CCM no cérebro do rato e reduz o custo e tempo necessário para o fenótipo desses animais.
Protocol
Representative Results
Discussion
CCM é uma malformação vascular comum que afeta até 0,5% de indivíduos1. CCM pode ocorrer de forma esporádica ou familiar. Prognóstico do paciente é muitas vezes pouco claro como lesões CCM podem romper inesperadamente para causar acidente vascular cerebral e outras consequências neurológicas. Atualmente, a único tratamento opção é remover cirurgicamente lesões, que são acompanhadas de alto risco.
Recentemente foram reproduzidas em condições humanas de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem as instalações e a assistência científica e técnica de a Sydney microscopia & microanálise Research Facility (AMMRF) e o centro australiano para microscopia & microanálise (ACMM) na Universidade de Sydney. Estes estudos foram apoiados pela Australian National Health e projeto de Conselho de pesquisa médica (NHMRC) conceder 161558 e APP1124011 (XZ).
Materials
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
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