פרוטוקול זה מתאר את טכניקות שונות הדרושות במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים כולל צביעת שלילי, חלוקתה ודק במיוחד עבור מבנה נתונים היסטוריים, חיסונית-זהב labelling כדי לקבוע את המיקום של חלבונים ספציפיים ב- exosomes.
Exosomes בגודל ננו שלפוחית חוץ-תאית מופרש על ידי נוזלי הגוף, ידועים כדי לייצג את המאפיינים של תאים מפרישים אותם. התכנים ואת המורפולוגיה של השלפוחיות המוגלתיות המופרש לשקף בהתנהגות התא או מצב פיזיולוגי, לדוגמה צמיחת תאים, הגירה, המחשוף ומוות. התפקיד של exosomes תלויה מאוד בגודל, הגודל של exosomes משתנה בין 30 ל- 300 ננומטר. השיטה הנפוצה ביותר עבור הדמיה exosome הוא מכתים שלילי, ואילו תוצאות אחרות מבוססות על מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה-הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מיקרוסקופ כוח אטומי. המורפולוגיה של exosome טיפוסי העריך דרך מכתים שלילי גביע-צורה, אבל עוד יותר פרטים עדיין אינן ברורות. מאופיין היטב באמצעות לימוד המבנית exosome הוא הכרחי במיוחד בתחומים הרפואי ובתחום הרוקחות. לכן, מורפולוגיה תלוית פונקציה צריך להיות מאומת על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים טכניקות כגון תיוג חלבון מסוים במבנה נתונים היסטוריים של exosome. להתבונן מבנה נתונים היסטוריים, הושוו תמונות משרטוטי זגוגית ותמונות מוכתם השלילי של exosomes. ב פרוטוקול זה, אנו מציעים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים עבור ההדמיה של exosomes כולל צביעת שלילי, מכתים חיסונית הר שלמה, הכנה בלוק, מקטע דק, וסימון חיסונית-זהב.
חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם השומנים bilayer שלפוחית מופרש על ידי תאי, גודלם נע בין 30 עד 300 ננומטר. EVs דווחו לראשונה בשנת 1978 עם עדויות שלפוחית של חולים עם מחלת הודג’קין1. שלפוחית אלה דווחו להיות 40 עד 120 ננומטר בגודלם. בשנת 1980, נמסר EVs מעורבים פקקת, היווצרות קריש דם בתוך כלי דם סרטן המטופלים2ומערכת קרישת הדם. אחרי 30 שנה, EVs דווחו להיות גורם חשוב לקדם את הגידול הפלישה, הבריחה מחוסן ואנגיוגנזה3. בנוסף, הפונקציות של EVs נחקרו כמבקרי באינטראקציה תאית בתחומים של דלקת, הפרעות המערכת החיסונית, מחלות נוירולוגיות סרטן4. EVs מכילות מולקולות ספציפיות כגון חלבון, mRNA microRNA5, שלהם פוטנציאל היישום אבחון ו הרפוי מאז שנותחה6,7. EVs הם קטגוריה מורכבת של קבוצות כולל exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticles, promininosomes, argosomes ו exosome דמויי שלפוחית, בהתאם מקור הסלולר שלהם פונקציה ביולוגית3. בנוסף, על סמך להן שלהם, EVs אלה ניתן לחלק שלפוחיות זעירות (שלפוחיות זעירות לסככה, nm 100-1000) ו- exosomes (30-300 ננומטר)8,9. בין אלה, exosome דווחה מתקשרת תא התגובה החיסונית10,11,סרטן12של מחלה זיהומית13.
עניין exosomes כמו סמן לאבחון מוקדם גדלה במהירות, לטיהור ודה -אפיון של exosomes חייב להיות מלווה עם טכניקות הדמיה מולקולרית. גדלים מורפולוגיות של exosomes, בהתאם שלהם מוצא ותפקוד14, ניתן להבחין על ידי טכניקות במיקרוסקופ עם רזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים. רוב exosomes היו דמיינו ידי שלילי מוכתם הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM)15,16,17, תוצאות אלה שאושרו על-ידי immunolabeling של חלבון ספציפי ב הר כל שלפוחית 18. מספר קבוצות המחקר דיווחו על המבנה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מיקרוסקופ כוח אטומי19,20, הקפאה-TEM21,22. עם זאת, ואילו טכניקות אלה שימושיים עבור לימוד מבנה exosome, הם אינם מספיקים להתבוננות המיקום של חלבונים ספציפיים הממוקם בתוך exosome. לכן, הצגנו פרוטוקול הדמיה exosomes עם תוויות של חלבון ספציפי. אנחנו מוחלים בלוק הכנה, חלוקתה ודק במיוחד ו immunostaining עבור ברור מיקום מפורט של החלבון exosome. זה היה לעומת מכתים שלילי ואת כל הר immunostaining, המשמש באופן מסורתי אפיון exosome.
מאמר זה מציג פרוטוקול להתבוננות המבנה של exosome מפורט תיוג מהחלבונים ספציפיים. צביעת שליליות נחשב כמו השיטה הטובה ביותר עבור exosome הדמיה17. הטכניקה המקובלת הזו מראה מבנה דמוי ספל של exosomes. עם זאת, צורת גביע היא צורה של החפץ יכול להתרחש עקב תהליך הייבוש. הקפאה-TEM התוצאות הראו כי exosomes י…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי הצלת חיים & תוכנית פיתוח טכנולוגיה רפואית של קרן המחקר הלאומי (NRF) & ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP & MOHW) (מספר 2016M3A9B6904244). אנו מודים גם חברי המרכז לחקר Medicinal Bioconvergence טיהור של exosome.
Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
Ultra-microtome | Leica | UCT | |
Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
Lead citrate | EMS | 17900 | |
Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
nickel grid | EMS | G200-Ni | |
Copper grid | EMS | G200-Cu | |
glycine | SIGMA | 022K5404 | |
Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
1st Antibody | purification in manually | ||
Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
silver paint | CANS | CTP100 | |
aluminum stub | EMS | 75622 | |
FIB-SEM | Zeiss | AURIGA | |
Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
Carbon grid | EMS | 121119 | |
Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |