サンプル準備および透過電子顕微鏡によるエクソソームのイメージ投射
Summary
このプロトコルでは、否定的な汚損、詳細な構造と免疫金エクソソームの特定の蛋白質の位置を判断するための極薄断面透過型電子顕微鏡に必要な様々 なテクニックについて説明します。
Abstract
エクソソームは体液によって分泌されるナノ細胞小胞であり、それらを分泌する細胞の特性を表すために知られています。分泌小胞の形態と内容は、セルの動作または生理学的状態、たとえば細胞増殖、移行、胸の谷間と死を反映します。エクソソームの役割のサイズに非常に依存し、エクソソームのサイズ、30 ~ 300 nm。エキソソーム イメージングのため最も広く使用されている方法が否定的な汚損、その他の結果は、クライオ電子顕微鏡、走査電子顕微鏡、原子間力顕微鏡に基づいていますが。典型的なエキソソームの形態の否定的な汚損によって評価はカップの形状が、さらに詳細はまだ分からない。エキソソームの構造研究を特徴は医学・薬学分野の特定の必要です。したがって、関数に依存した形態はエキソソームの詳細構造の特定の蛋白質のラベル付けなどの電子顕微鏡検査の技術によって検証すべき。詳細な構造を観察するには、エクソソームの負の染色像と極薄, 切片画像を比較しました。このプロトコルでは、私達は否定的な汚損、全体マウント免疫染色、ブロック作製、薄セクション、および免疫金ラベルを含むエクソソームのイメージングのための透過型電子顕微鏡を提案します。
Introduction
細胞小胞 (Ev) は、細胞から分泌される脂質二分子膜ベシクル、30、300 nm 間のサイズの範囲します。EVs は、ホジキン病1患者の小胞からの証拠と、1978 年に最初に報告されました。これらの小胞はサイズ 40 に 120 ナノメートルと報告されました。1980 年に、EVs が凝固系と血栓症、癌患者2の血管内血栓の形成に関与していることが報告されました。30 年後、EVs は、浸潤、免疫回避、および血管新生3を促進するために重要な要因であること報告されています。さらに、EVs 機能は、炎症、免疫障害、神経疾患、がん4の領域における細胞間相互作用のレギュレータとして研究されています。EVs は、マイクロ Rna5mRNA、タンパク質など特定の生体分子を含む、診断および治療の潜在的な応用解析6,7されています。EVs は、エクソソーム、prostasomes、oncosomes、dexosomes、微粒子、promininosomes、argosomes、およびエキソソームのような小胞細胞の起源および生物学的機能3によってを含むサブグループから成るカテゴリです。さらに、彼らの器官を基に、これらの EVs に分かれます (小屋機構の解明、100-1000 nm) 機構の解明およびエクソソーム (30-300 nm)8,9。これらのうち、免疫応答10、癌11,12、および伝染病13セル コミュニケーターとして、エキソソームを報告されています。
早期診断マーカーとしてエクソソームの関心が急速に高まっていると精製とエクソソームの性質は、分子イメージング技術と同伴が必要があります。その起源と機能を14、に応じて、エクソソームの形態とさまざまなサイズは、電子顕微鏡などの高解像度の顕微鏡検査の技術によって区別できます。ほとんどエクソソームいた否定的なステンド グラス透過電子顕微鏡 (TEM)15,16,17、可視化し、これらの結果は、全台紙の小胞の特定の蛋白質の反応によって確認されました。18. いくつかの研究グループは、走査電子顕微鏡、原子間力顕微鏡19、20、および低温電子顕微鏡 TEM21,22によって構造を報告しています。ただし、これらのテクニックはエキソソーム構造を調べる場合に役立ちますが、彼ら、エキソソームの内側にある特定の蛋白質の位置観測のために十分ではありません。したがって、特定の蛋白質のラベリングとエクソソームをイメージングするためのプロトコルを導入しました。我々 は、ブロック準備、極薄切片および免疫染色、エキソソームのタンパク質の詳細な場所を判別するに適用されます。否定的な汚損と全体マウント免疫染色は、昔から、エキソソームの特性と比較しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、詳細なエキソソームの構造を観察し、その特定の蛋白質の分類のためのプロトコルを示します。否定的な汚損はエキソソーム17をイメージングに最適な方法として考えられています。この手法は、エクソソームのカップ状の構造を示しています。しかし、このカップの形状は乾燥プロセスによって発生するアーチファクトのフォームです。低温電子顕微鏡 TEM …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は生物によって支えられた & 医療技術開発プログラム国立研究財団 (NRF) の & 韓国の政府によって資金を供給 (MSIP & MOHW) (第 2016M3A9B6904244)。私たちもエキソソームの浄化の薬用 Bioconvergence 研究センターのメンバーに感謝します。
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| silver paint | CANS | CTP100 | |
| aluminum stub | EMS | 75622 | |
| FIB-SEM | Zeiss | AURIGA | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
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