Preparação da amostra e a imagem latente de Exosomes por microscopia eletrônica de transmissão
Summary
Este protocolo descreve as várias técnicas necessárias para microscopia eletrônica de transmissão incluindo coloração negativa, seccionamento ultrafinos de estrutura detalhada e imuno-ouro rotulagem para determinar as posições de proteínas específicas em exosomes.
Abstract
Exosomes são nanométricas vesículas extracelulares secretadas por fluidos corporais e são conhecidos para representar as características das células que secretam-los. O conteúdo e a morfologia das vesículas secretadas refletem o comportamento celular ou estado fisiológico, por exemplo, crescimento celular, migração, decote e morte. Papel do exosomes pode dependem altamente tamanho e o tamanho de exosomes varia de 30 a 300 nm. O método mais utilizado para tratamento de imagens exossomo é coloração negativa, enquanto outros resultados baseiam-se na microscopia de elétron de Cryo-transmissão, microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica. Morfologia do exossomo o típico avaliada através de coloração negativa é uma em forma de taça, mas ainda mais detalhes ainda não estão claras. Um exossomo bem caracterizado por meio de estudo estrutural é especialmente necessário nas áreas médicas e farmacêuticas. Portanto, a morfologia função dependente deve ser verificada por técnicas de microscopia eletrônica, por exemplo marcando uma proteína específica da estrutura detalhada do exossomo. Para observar a estrutura detalhada, imagens secionadas ultrafinos e imagens negativas manchadas, de exosomes foram comparadas. Neste protocolo, sugerimos a microscopia eletrônica de transmissão para a imagem latente de exosomes incluindo coloração negativa, toda montagem imuno-coloração, preparação de bloco, seção fina e rotulagem imuno-ouro.
Introduction
Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas de bicamada lipídica secretadas pelas células, e seu tamanho varia entre 30 e 300 nm. SVE foram relatados primeiramente em 1978, com evidência de vesículas de pacientes com doença de Hodgkin1. Essas vesículas foram relatadas para ser de 40 a 120 nanômetros de tamanho. Em 1980, foi relatado que EVs estão envolvidos no sistema de coagulação e trombose, formação de um coágulo de sangue dentro de um vaso sanguíneo no câncer pacientes2. Depois de 30 anos, registaram-se um fator importante para promover a invasão do tumor, fuga imune e angiogênese3EVs. Além disso, as funções de EVs têm sido estudadas como reguladores em interacções celulares nas áreas de inflamação, distúrbio imunológico, doenças neurológicas e câncer4. Desde EVs contêm biomoléculas específicas tais como proteínas e RNAm microRNA5, sua potencial aplicação no diagnóstico e terapêutica tem sido analisados6,7. Sve é uma categoria composta por subgrupos, incluindo exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, micropartículas, promininosomes, argosomes e exossomo como vesículas, dependendo da sua origem celular e função biológica3. Além disso, com base na sua biogênese, esses EVs podem ser divididos em aumentada (galpão aumentada, 100-1000 nm) e exosomes (30-300 nm)8,9. Entre estes, o exossomo tem sido relatado como um comunicador de célula para resposta imune10, câncer11,12e doenças infecciosas13.
Interesse no exosomes como um biomarcador para o diagnóstico precoce está a aumentar rapidamente, e a purificação e caracterização de exosomes devem ser acompanhados com técnicas de imagem moleculares. Os diferentes tamanhos e morfologias de exosomes, dependendo de sua origem e função14, podem ser distinguidas por técnicas de microscopia de alta resolução, tais como a microscopia eletrônica. Exosomes maioria dos foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) negativo manchada15,16,17, e esses resultados foram confirmados por immunolabeling de uma proteína específica em toda montagem vesículas 18. diversos grupos de pesquisa relataram a estrutura através de microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica19,20e21,de Cryo-TEM22. No entanto, enquanto estas técnicas são úteis para estudar a estrutura do exossomo, eles são insuficientes para observar a posição de proteínas específicas, localizado no interior do exossomo. Portanto, nós introduzimos um protocolo para exosomes com uma proteína específica rotulagem de imagem. Nós aplicamos a preparação do bloco, seccionamento ultrafinos e imunocoloração para determinar a localização detalhada da proteína do exossomo. Isso foi comparado com coloração negativa e todo imunocoloração de montagem, que é tradicionalmente utilizada para a caracterização do exossomo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo apresenta um protocolo para observar a estrutura do exossomo a detalhada e rotulagem de suas proteínas específicas. Coloração negativa tem sido considerado como o melhor método para exossomo de imagem17. Esta técnica convencional mostrou-se estrutura de forma de Taça dos exosomes. No entanto, esta forma de xícara é uma forma de artefato que pode ocorrer devido ao processo de secagem. Cryo-TEM resultados têm mostrado que o exosomes tem uma estrutura perfeitamente esférica em …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo Bio & programa de desenvolvimento de tecnologia médica da Fundação Nacional de pesquisa (NRF) & financiado pelo governo coreano (MSIP & MOHW) (n º 2016M3A9B6904244). Agradecemos também a membros do centro de pesquisa Bioconvergence de medicamentos para a purificação do exossomo.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| silver paint | CANS | CTP100 | |
| aluminum stub | EMS | 75622 | |
| FIB-SEM | Zeiss | AURIGA | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
Riferimenti
- Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin’s disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
- Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
- Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
- Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles – a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases?. Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
- Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
- Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).
