Um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no Regulamento de autofagia na Placenta
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para amostragem de tecido placentário humano das vilosidades seguido pelo isolamento de cytotrophoblasts para cultura de células primárias. Tratamento de trophoblasts com TNFa recapitula a inflamação no ambiente intra-uterino obeso e facilita a descoberta de alvos moleculares regulada pela inflamação na placenta com obesidade materna.
Abstract
Obesidade materna está associada com um risco aumentado de resultados perinatais adversos que são provavelmente mediadas por comprometido função placentária que pode ser atribuída, em parte, a desregulação de autofagia. Aberrantes alterações na expressão dos reguladores de autofagia nas placentas de gestações obesas podem ser regulamentadas por processos inflamatórios associados com obesidade e gravidez. Descrito aqui é um protocolo para a recolha de amostras de tecido das vilosidades e isolamento de cytotrophoblasts das vilosidades da placenta humana termo para cultura de células primárias. Isto é seguido por um método para simular o milieu inflamatório no ambiente intra-uterino obeso, tratando trophoblasts primários de gravidezes magras com fator de necrose tumoral alfa (TNFa), uma citocina proinflammatory que é elevada na obesidade e no gravidez. Através da implementação do protocolo descrito aqui, encontra-se que a exposição a exógena TNFa regula a expressão do Rubicão, um regulador negativo de autofagia, em trophoblasts de magras gravidezes com fetos do sexo femininos. Embora uma variedade de fatores biológicos no ambiente intra-uterino obeso manter o potencial de modular caminhos críticos no trophoblasts, este sistema ex vivo é especialmente útil para determinar se os padrões de expressão observada na vivo na placenta humana com obesidade materna são um resultado direto de TNFa sinalização. Em última análise, essa abordagem oferece a oportunidade de analisar as implicações regulamentares e moleculares da inflamação associada com obesidade materna na autofagia e outras vias celulares críticas no trophoblasts que têm o potencial de impacto função da placenta.
Introduction
A obesidade é um estado inflamatório, caracterizado por inflamação crônica de baixo grau, decorrentes de excesso de tecido adiposo e disponibilidade de nutrientes. Na obesidade, cytokines proinflammatory são elevados em tecidos metabólicos, bem como sistemicamente em circulação. Um conjunto robusto de provas demonstrou que TNFa é significativamente elevada no cenário da obesidade com implicações na resistência à insulina e disfunção metabólica1. Ativação de TNFa também contribui para a patogênese da doença em condições tais como câncer e auto-imunidade, tornando-se uma atraente alvo terapêutico2.
Inflamação na obesidade é agravada pela gravidez, também, um estado proinflammatory3,4. Anteriormente mostrou que aumenta o conteúdo de TNFa placentário com adiposidade materna em gestações com fetos do sexo femininos. Além disso, tratamento de TNFa inibe a respiração mitocondrial nas células do trofoblasto feminino mas não masculino, sugerindo que o TNFa está envolvida na regulação do metabolismo da placenta em uma maneira sexualmente dimórficos5. Obesidade materna está associada com o aumento da incidência de uma variedade de complicações durante a gravidez, incluindo natimorto, com fetos masculinos, sendo a mais suscetível de3,6,7,8 . Devido ao seu papel chave na interface materno-fetal, alterações na capacidade funcional da placenta no ambiente intra-uterino obeso em resposta a sinalização inflamatória podem desempenhar um papel importante na mediação os resultados das gestações obesos.
Cytotrophoblasts e syncytiotrophoblasts no tecido das vilosidades da placenta são críticos para a troca de nutrientes e oxigênio entre a mãe e o desenvolvimento do feto9e sinalização do sistema endócrino. Interrupções na capacidade funcional de cytotrophoblasts das vilosidades (doravante referida como trophoblasts) podem colocar em risco a saúde fetal e desenvolvimento. Este protocolo descreve um método para amostragem de tecido das vilosidades da placenta humana termo embora dissecando as placas coriônica e basais, juntamente com um processo otimizado para o isolamento de trophoblasts para cultura de células primárias. Este protocolo é derivado de metodologias estabelecidas envolvendo digestão enzimática do tecido das vilosidades para liberar as células da matriz extracelular, seguido por centrifugação diferencial de densidade para isolar trophoblasts10, 11,12. Este detalhes de protocolo uma abordagem em que trophoblasts primários de placentas de gestações magras são tratados com meio de cultura suplementado com TNFa para simular um componente do meio de inflamatória associada com obesidade materna. Finalmente, um procedimento simples para a colheita do lisado celular total de TNFa-tratados trophoblasts, seguidos por Western borram para detectar alterações na expressão gênica é descrito.
Enquanto esse modelo não recapitular o obesogénico no utero ambiente em sua totalidade, ele fornece um sistema controlado que permite analisar a contribuição individual de inflamação mediada por TNFa em resposta a trophoblasts a obesidade materna. Este modelo proporciona a ambos a oportunidade de descobrir ou confirmar alvos moleculares diretamente regulamentados pela sinalização de TNFa em trophoblasts, bem como permite testar se observadas alterações em padrões de expressão de gene na vivo na placenta com maternal a obesidade pode ser resultado de inflamação mediada por TNFa.
A abordagem descrita aqui foi implementada para testar o efeito da inflamação mediada por TNFa sobre o Regulamento de autofagia em trophoblasts humanas. Trophoblasts de obesos gravidezes com fetos do sexo masculino apresentam interrompido autophagic volume de negócios, ou de maturação autophagosome13. Uma proteína chamada Rubicon (RUN domínio da proteína Beclin1-interagindo e rica em cisteína contendo), que está localizada a lisossomos e tarde endossomos, tem sido recentemente descrito como um “freio” no processo de autophagic de volume de negócios porque funciona como um negativo regulador de maturação de autophagosome14,15. Na verdade, Rubicon é um raro exemplo de uma proteína que impede a autofagia, o que o torna um alvo terapêutico valioso. Muito pouca informação está disponível sobre o significado fisiopatológico de Rubicon, exceto por seus papéis na resposta imune inata para microbials16,17 e casos proteção18. Usando o protocolo descrito aqui, se verificar que o Rubicon é upregulated em femininos trophoblasts primárias em resposta ao tratamento com concentrações crescentes de TNFa até 250 pg/mL. O Regulamento de Rubicon pode desempenhar um papel na tarifa de fetos como feminino melhor do que os machos em gestações com obesidade materna. Recapitulando a inflamação associada com obesidade materna ex vivo expondo trophoblasts humanos para TNFa exógena fornece uma plataforma para estudar o impacto do ambiente intra-uterino obeso na regulamentação dos caminhos críticos no Trophoblasts e, por extensão, a função placentária.
Protocol
Representative Results
Discussion
A placenta, responsável pela regulação do crescimento do feto, exibe a função comprometida no ambiente obesos6. Apesar da alta demanda metabólica de trophoblasts, placenta com obesidade materna apresentam respiração mitocondrial disfuncional6,19. Alterações no metabolismo da placenta podem contribuir para o aumento da incidência de complicações e resultados de fetais adversos observados em gravidezes obesos3<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer as mulheres que doaram suas placentas para este estudo. Agradecemos também o departamento de entrega na OHSU e materno e Fetal equipe de pesquisa e trabalho para coordenar a coleção de placenta. Nós estamos gratos ao Eric Wang, pH.d. e Kelly Kuo, MD para apoio e ajuda com métodos experimentais e otimização.
Este trabalho foi financiado pelo NIH HD076259A (AM) e AHA GRNT29960007 (AM).
Materials
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
Riferimenti
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