Microstructured apparaten voor geoptimaliseerde Microinjection en beeldvorming van zebravis larven
Summary
Microinjection van zebravis embryo’s en larven is een essentieel maar uitdagende techniek gebruikt in vele zebrafish modellen. Hier presenteren we een scala van microscale instrumenten om te helpen bij de stabilisatie en de oriëntatie van de zebravis voor zowel microinjection en beeldbewerking.
Abstract
Zebravis hebben ontpopt als een krachtig model voor verschillende ziekten bij de mens en een nuttig instrument voor een toenemend aantal experimentele studies die, verspreid over fundamentele ontwikkelingsbiologie via aan grootschalige genetische en chemische schermen. Echter, veel experimenten, met name die met betrekking tot infectie en xenograft modellen, rekenen op microinjection en beeldvorming van embryo’s en larven, die moeizaam technieken die vaardigheid en expertise vereisen. Ter verbetering van de precisie en de doorvoer van huidige microinjection technieken, ontwikkelden we een reeks van microstructured apparaten te oriënteren en stabiliseren van de zebravis embryo’s op 2 dagen post bevruchting (dpf) in ventrale, dorsal of laterale richting voorafgaand aan de procedure. Om te helpen bij de beeldvorming van embryo’s, ontwierpen we ook een eenvoudig apparaat met kanalen die 4 zebrafish lateraal parallel tegen een glas cover slip oriënteren. Samen, tonen de instrumenten die wij hier presenteren de effectiviteit van photolithographic benaderingen voor het genereren van nuttige apparaten voor de optimalisatie van de zebravis technieken.
Introduction
Zebravis hebben ontpopt als een krachtig model voor veel velden uit studies van de fundamentele ontwikkelingsbiologie aan grootschalige genetische en chemische schermen1,2. Routine genetische manipulaties, zoals overexpressie van het gen, knockdown, CRISPR/Cas9 mutagenese en Transgenese afhankelijk van microinjection van genetisch materiaal in de zygote eencellige, die heeft geleid tot de ontwikkeling van eenvoudige, easy-to-use, commercieel beschikbare hulpmiddelen voor oriënteren en eieren voor injectie3te stabiliseren. Andere benaderingen, zoals transplantatie en infectie, vereisen vaak microinjection in later stadium embryo’s en larven met grotere spoorbreedte capillaire naalden4. Gebruik van grotere spoorbreedte naalden kampt echter met grote technische uitdagingen, zoals het is moeilijker om te penetreren het doelweefsel is terechtgekomen zonder duwen of rollen van het embryo. Onder deze omstandigheden wellicht het verkrijgen van de juiste water spanning nodig om te stabiliseren van het embryo, terwijl het vermijden van drogen tijdens de procedure moeilijk is, en de embryo’s niet ideaal georiënteerd voor injectie in het doelweefsel.
Naar aanleiding van microinjection is het vaak handig om het scherm van de geïnjecteerde embryo’s te selecteren die met succes zijn ingespoten en opnames van de eerste tijdstip. Om deze uitdagingen, hebben we een waaier van microstructured apparaten die bijdragen aan het stabiliseren van 2 dpf-embryo’s in verschillende richtingen microinjection5, zowel voor snelle beeld-gebaseerde screening na injectie.
Voor het verkrijgen van voldoende structurele resolutie in deze apparaten, we photolithographic technieken gebruikt. Gebruikte micro-elektronische industrieën en meer onlangs geëxtrapoleerd naar microfluidic fabricage, kunnen deze benaderingen verticale structuren, variërend van 1-1000 µm, een schaal geschikt voor manipulatie van zebravis embryo’s en larven. Alle apparaten werden vervaardigd gebruikend Polydimethylsiloxaan (PDMS), die goedkoop, fysiek robuuste biologisch inert en transparant is.
Microstructured oppervlakte matrices (MSAs) werden opgemaakt als blokken voor PDMS met een patroon bovenvlak, analoog aan de eenvoudige kanalen in agarose blokken gebruikte voor ei microinjection. Voor na injectie voorstelling kan 6 imaging-apparatuur worden gekleed in een standaard glassbottom 6-well plaat. Deze apparaten zijn ontworpen voor het eenvoudig laden van embryo’s, terwijl de lossen procedure kan gunstig redding van specifieke embryo’s, vergemakkelijken van beeld-gebaseerde benaderingen in een meer gebruikersvriendelijke manier dan die apparaten screening eerder ontwikkeld door de Beebe laboratorium6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we het gebruik van apparaten we onlangs ontwikkeld om 2 dpf zebrafish microinjection5te vergemakkelijken, en de invoering van een eenvoudige agarose-gratis montage apparaat voor handige beeldvorming van embryo’s. Deze hulpprogramma’s markeren het nut van photolithographic technieken voor de fabricage van apparaten die nuttig zijn voor de zebravis technieken.
Wij hebben gevonden MSA apparaten vooral handig voor injectie van cellen of deeltjes vatbaar voo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank David Langenau royaal voorzien van aquarium ruimte; Eric Stone, John C. Moore en Qin Tang voor helpen met onderhoud van de zebravis en reagentia, en Anne Robertson en Elliott Hagedorn van Leonard Zon van lab voor de aanschaf van de stam van de zebravis hier gebruikt. Ze wil ook bedanken Octavio Hurtado voor advies over photolithographic technieken. FE werd gefinancierd door beurzen uit de Shriner ziekenhuis voor kinderen en de American Australian Association. Dit werk werd gefinancierd door de NIH GM92804 verlenen.
Materials
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI – 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
Riferimenti
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
- Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
- Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
- Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
- Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
- Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
- Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).
- Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).
- Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
- Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
- Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).
