בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים
Summary
נתאר כאן שיטה פשוטה ומהירה בידודו של סלמונלה typhimurium-המכילה phagosomes של מקרופאגים על-ידי ציפוי החיידקים עם ביוטין ו streptavidin.
Abstract
סלמונלה typhimurium הוא חיידק תאיים עיצוב גבות הגורמת דלקת הקבה והמעים בבני אדם. לאחר הפלישה פרופריה. מוסקולריס, S. חיידקים typhimurium במהירות זוהה, phagocytized על ידי מקרופאגים, הכלול שלפוחית המכונה phagosomes על מנת להיות מושפל. בידוד של ס typhimurium-phagosomes המכיל היה בשימוש נרחב כדי ללמוד איך ס זיהום typhimurium משנה את תהליך ההבשלה phagosome כדי למנוע השפלה חיידקי. באופן קלאסי, בידודו של המכילים חיידקים phagosomes בוצעה על ידי צנטריפוגה הדרגתיות סוכרוז. עם זאת, תהליך זה זמן רב, דורש מידה מסוימת של מיומנות וציוד מיוחדים. המתוארים כאן היא שיטה פשוטה ומהירה על בידודו של ס typhimurium-המכילה phagosomes של מקרופאגים על-ידי ציפוי החיידקים עם ביוטין-streptavidin-מצומדת beads מגנטי. יכול להיות מושעים phagosomes המתקבלות בשיטה זו כל מאגר של בחירה, המאפשר הניצול של phagosomes מבודדים למגוון רחב של מבחני, כגון חלבון, מטבוליט ו ליפיד לניתוח. לסיכום, שיטה זו עבור בידודו של ס typhimurium-המכיל phagosomes ספציפיים, יעיל, מהיר, דורש ציוד מינימלי, תכליתי יותר מאשר השיטה הקלאסית של בידוד מאת סוכרוז הדרגתי-ultracentrifugation.
Introduction
המקרופאגים הם מסתובבים תאים phagocytic מיוחדים לזהות, לבלוע, לבזות את כל החלקיקים הזרים נוכח ברקמות היקפיים, החל מוות תאים כדי מיקרואורגניזמים כגון חיידקים פולשים. על פני השטח קולטן בתיווך זיהוי של סמנים הפתוגן הספציפי הנוכחי בדרך כלל על פני השטח של מיקרואורגניזמים (המכונה פתוגן-הקשורים לתבניות מולקולרי או PAMPs), מקרופאגים ליזום ומורכב של הממברנה התאית ב סדר כדי להקיף את הפתוגן1phagocytize.
הפתוגן אפף נכלל אז על ידי מקרופאג ב שלפוחית תאיים המכונה phagosome. דרך סדרה של פיוז’ן ואירועים ביקוע עם שלפוחית אחרים כגון endosomes ו- lysosomes, phagosome פתוגן המכיל רוכש ערכה של חלבונים הדרושים עבור חיסול של התוכן phagosomal. לכן, ההרכב אנזימטי של phagosome זה משתנה מאוד במהלך תהליך זה, המכונה ההבשלה phagosome2.
זמן קצר לאחר phagocytosis, multimeric ATPase vacuolar מורכבים (v-ATPase) הוא שולב קרום phagosome על ידי היתוך עם endosomes3. מתחם זה מנצל ATP כדי משאבת הפרוטונים מ ציטוזול כדי לומן של phagosome4. לחומצי phagosome חיוני עבור האירועים פיוז’ן עם אחרים שלפוחית5 , הפעלת מספר רב של אנזימים degradative תלויי-pH6. עוד מתחם אנזימטי multimeric במהירות שמתארגנת על קרום phagosome הוא המתחם nadph לאוקסידאז (NOX). NOX מורכבים מתחמצן nadph על מנת לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS) זה מופרשים לתוך לומן phagosome ואשר תורמות באופן משמעותי הריגתו של מיקרואורגניזמים אפף7.
במהלך השלבים הראשונים של התבגרות, phagosomes להציג סמני בדרך כלל כגון Rab5 ו- Rab7 של endosomes מוקדמות ומאוחרות בהתאמה יחד עם יחידת משנה0 V של v-ATPase8. פיוז’ן של phagosomes עם lysosomes ו- endosomes מאוחר תוצאות חשיפת המחלה phagocytized למגוון רחב של אנזימים hydrolytic כגון cathepsin פרוטאזות, lipases וβ-galactosidase9. לחומצי לומן נדרש גם ההפעלה של אנזימים אלה. לדוגמה, המחשוף של cathepsin D כדי לייצר טופס קצר פעיל הוא תלוי-pH10. אנזימים אלה לבזות את הפתוגן ולסיים את הייצור של פפטידים קצרים, נגזר הפתוגן מוצגים על ידי מקרופאג histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) class II מולקולות בתאי T כדי לעורר תגובה חיסונית אדפטיבית11.
לפיכך, phagosome ההבשלה הוא קריטי עבור התגובה החיסונית מולדת וקישורים הזרועות מולדת, גמישים של המערכת החיסונית. . זה לא מפתיע כי פתוגנים התפתחו אסטרטגיות כדי להתגבר על חיסול על ידי מקרופאגים לאורך התהליך המתואר לעיל של התבגרות phagosome… לדוגמה, החיידק תאיים שחפת Mycobacterium , הלגיונלה pneumophila למנוע ההבשלה phagosome על ידי מעכבים v-ATPase הרכבה ו לומן הסוגר acidification12,13 . חיידקים אחרים, כגון ליסטריה או שיגלה flexneri זירוז היווצרות נקבובית ממברנה phagosome להימלט אל ציטוזול ה-14,15. לעומת זאת, serovar enterica סלמונלה typhimurium (S. typhimurium) הוא מסוגל לשנות את המאפיינים של phagosome בתוך חלולית להפכו במיקום מתאים עבור שכפול שלו16. יכולת זו גורם S. typhimurium מודל מאוד מעניין ללמוד בתיווך הפתוגן הפרעה של התבגרות phagosome.
ס typhimurium הוא חיידק תאיים עיצוב גבות הגורמת דלקת הקבה והמעים בבני אדם. לאחר הפלישה פרופריה. מוסקולריס, ס חיידקים Typhimurium במהירות זוהה, phagocytized על ידי מקרופאגים, הנכלל phagosomes17. כמה דיווחים בעבר תיארו את ס typhimurium-phagosomes המכיל להציג למקבלי הן endosomes והן lysosomes18, מחקרים אחרים מצאו ליזוזום phagosome פיוז’ן מנעה על ס זיהום Typhimurium19.
בתחילה, phagosome ההבשלה על ס זיהום typhimurium נחקר על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. התפתחות טכניקות בידודו של המכילים חיידקים phagosomes התומך מחקר מדויק יותר של התוכן phagosome במונחים של סמנים אנדוזום, ליזוזום. נכון להיום, שיטת העיקרי המשמש את ניתוקה של המכילים חיידקים phagosomes הוא fractionation subcellular18,מעברי צבע של סוכרוז שלב20. עם זאת, שיטה זו דורשת מספר השלבים צנטריפוגה זה יכול לגרום לנזק מכני phagosomes, יכול להשפיע על היציבות של רכיבים phagosomal (חלבונים ושומנים), הוא זמן רב. יתר על כן, זה דורש את השימוש ultracentrifuge: פיסת ציוד מיוחד שאינו נגיש עבור כל מעבדה.
לאחרונה הוחל גישה חדשה את בידודה של בקטריאלי המכיל phagosomes, שבו פתוגנים חיידקיים מסומנות עם biotinylated lipopetide (Lipobiotin) ומאוחר יותר חילוץ באמצעות streptavidin מצומדת beads מגנטי21 . אנו מציעים שיטה משלימה חלופית על-ידי תיוג חיידקי משטח המכיל amine מקרומולקולות עם NHS-ביוטין ואחריו streptavidin מצומדת beads מגנטי. Phagosomes המתקבלות בשיטה זו מאוד מועשרים בסמני אנדוזום, ליזוזום והוא יכול לשמש למגוון רחב של מבחני, מניתוח חלבון טכנולוגיות לניתוח. בנוסף, זה אינו מצריך ציוד מיוחד כגון ultracentrifuges. יתר על כן, על ידי ביטול השלבים צנטריפוגה, הנזק מכני phagosomes והן את כמות הזמן המועסקים הם מופחת במידה ניכרת. בשיטה זו ניתן להתאים בקלות בידוד של phagosomes המכילה חיידקים אחרים, כגון גראם חיוביים Staphylococcus aureus, כללה גם כתב יד זה. לסיכום, שיטה זו עבור בידודו של ס typhimurium-המכיל phagosomes הוא משחק פשוט, חסכוני, חינוך, פחות זמן רב יותר הבידוד קלאסית מאת סוכרוז הדרגתי-ultracentrifugation, עיבוד מאוד המכיל חיידקים phagosomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה חדשה עבור בידודו של ס typhimurium-המכילה phagosomes על-ידי ציפוי החיידק ביוטין, streptavidin מצומדת beads מגנטי מתואר כאן. לאחר הפרעה עדין של קרום התא, phagosomes המכיל חיידקים ניתן בקלות לחלץ באמצעות מתלה מגנטי. אנו מראים כי תיוג של החיידקים המשמרת את הקיבולת של המחלה כדי לגרום לדלקת, אינה משנה את ה?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר במעבדה של רובינסון הוא נתמך על ידי מימון מהאשכול מצוינות קלן על תגובות הלחץ הסלולר במחלות Aging-Associated, אוניברסיטת קלן, גרמניה (CECAD; במימון של DFG בתוך יוזמה מצוינות של הפדרלי הגרמני, המדינה ממשלות) ומענקים פתוח (SFB 670), הון קלן, מריה-Pesch יסודות אוניברסיטת קלן, גרמניה.
Materials
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
Riferimenti
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
