Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages
Summary
We beschrijven hier een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van Salmonella typhimurium-phagosomes van macrofagen bevattende coating van de bacteriën met biotine en daar.
Abstract
Salmonella typhimurium is een facultatief intracellulaire bacterie die gastro-enteritis bij mensen veroorzaakt. Na de invasie van de lamina propria, S. typhimurium bacteriën zijn snel gedetecteerd en phagocytized door macrofagen en in blaasjes bekend als phagosomes om te worden afgebroken. Isolatie van S. typhimurium-met phagosomes hebben op grote schaal gebruikt om te bestuderen hoe S. typhimurium infectie verandert het proces van rijping van het phagosome ter voorkoming van bacteriële afbraak. Klassiek, het isolement van de bacteriën-bevattende phagosomes is verricht door sacharose kleurovergang centrifugeren. Dit proces is echter tijdrovend, en vereist gespecialiseerde apparatuur en een zekere mate van beweeglijkheid. Hier beschreven is een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van S. typhimurium-phagosomes van macrofagen bevattende coating van de bacteriën met biotine-daar-geconjugeerde magnetische kralen. Phagosomes volgens deze methode verkregen kunnen worden opgeschort in een buffer van keuze, waardoor het gebruik van geïsoleerde phagosomes voor een breed scala van tests, zoals eiwitten, metaboliet, en lipide-analyse. Kortom, deze methode voor de isolatie van S. typhimurium-bevattende phagosomes is specifiek, efficiënte, snelle, vereist minimale apparatuur en is veelzijdiger dan de klassieke methode van isolatie door sacharose verloop-ultracentrifugatie.
Introduction
Macrofagen circuleren gespecialiseerde fagocytische cellen die detecteren, verzwelgen en degraderen van een buitenlandse deeltje in perifere weefsels, variërend van apoptotic cellen tot invasie van micro-organismen zoals bacteriën aanwezig. Oppervlakte receptor-gemedieerde erkenning van pathogen specifieke markers vaak aanwezig op het oppervlak van micro-organismen (bekend als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen of PAMPs) leidt macrofagen een complexe reorganisatie van cellulaire membraan in om te omringen en phagocytize van de pathogeen-1.
Het overspoeld pathogeen is vervolgens opgenomen door de macrofaag in een intracellulair vesikel bekend als phagosome. Door een reeks van kernfusie en kernsplijting evenementen met andere blaasjes zoals Endosomen en lysosomes verwerft de pathogeen-bevattende phagosome een reeks eiwitten die nodig zijn voor de afschaffing van de phagosomal inhoud. Daarom is de enzymatische samenstelling van de phagosome in de loop van dit proces, bekend als phagosome rijping2zeer variabel.
Kort na de fagocytose, de multimeric complexe vacuolar ATPase (v-ATPase) is opgenomen in het phagosome-membraan door fusie met Endosomen3. Dit complex maakt gebruik van ATP aan pomp protonen uit het cytosol naar het lumen van het phagosome4. Verzuring van de phagosome is essentieel voor de gebeurtenissen van de fusie met andere blaasjes5 en voor de activatie van een groot aantal pH-afhankelijke afbraakroutes enzymen6. Een ander multimeric enzymatische complex dat is snel gemonteerd op het phagosome-membraan is het complex van NADPH-oxidase (NOX). NOX complexe oxideert NADPH om te produceren van reactieve zuurstof soorten (ROS) die worden uitgescheiden in de phagosome lumen en die aanzienlijk bijdragen tot het doden van de overspoeld micro-organismen7.
Tijdens de eerste stappen van rijping presenteren phagosomes markeringen typisch zoals Rab5 en Rab7 van vroege en late Endosomen respectievelijk samen met de subeenheid0 V van de v-ATPase-8. Fusie van phagosomes met lysosomen en laat Endosomen resulteert in de blootstelling van de phagocytized pathogen aan een breed scala aan hydrolytische enzymen zoals β-galactosidase9cathepsin proteasen en lipasen. Verzuring van de lumen is ook vereist voor de activering van deze enzymen. Bijvoorbeeld, is het splijten van cathepsin D voor de productie van de actieve korte vorm pH-afhankelijke10. Deze enzymen degraderen van het pathogene agens en bemiddelen van de productie van pathogen afkomstige korte peptides, die door de macrofaag grote histocompatibility complex (MHC) klasse II moleculen naar T cellen activeren een adaptieve immuunrespons11gepresenteerd.
Vandaar, phagosome rijping is cruciaal voor de aangeboren immuunrespons en verbindt de aangeboren en adaptieve takken van het immuunsysteem. Het is geen verrassing dat de ziekteverwekkers geëvolueerd zijn strategieën om te overwinnen afschaffing door macrofagen door het hierboven beschreven proces van rijping van de phagosome. Bijvoorbeeld de intracellulaire bacteriën Mycobacterium tuberculosis en Legionella pneumophila voorkomen dat phagosome rijping remmende v-ATPase vergadering en daaruit voortvloeiende lumen verzuring met12,13 . Andere bacteriën, zoals Listeria monocytogenes of Shigella flexneri induceren porie vorming in het membraan van de phagosome te ontsnappen naar het cytosol14,15. Aan de andere kant, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) is het kundig voor wijzigen van de eigenschappen van de phagosome binnen de vacuole om te zetten in een geschikte locatie voor de replicatie-16. Dit vermogen maakt S. typhimurium een zeer interessant model te bestuderen van de pathogeen-gemedieerde inmenging van phagosome rijping.
S. typhimurium is een facultatief intracellulaire bacterie die gastro-enteritis bij mensen veroorzaakt. Na de invasie van de lamina propria, S. Typhimurium bacteriën zijn snel gedetecteerd en phagocytized door macrofagen en deel uitmaakt van phagosomes17. Sommige rapporten hebben eerder beschreven dat S. typhimurium-met phagosomes presenteren makers voor zowel Endosomen als lysosomen18, en andere studies hebben gevonden phagosome-lysosoom fusion voorkomen op S. Typhimurium infectie19.
In eerste instantie phagosome rijping op S. typhimurium infectie is onderzocht door immunofluorescentie microscopie. De ontwikkeling van technieken voor de isolatie van de bacteriën-bevattende phagosomes ingeschakeld een nauwkeuriger onderzoek van de inhoud van de phagosome in termen van endosome en lysosoom markers. Tot op heden, de belangrijkste methode die wordt gebruikt voor de isolatie van de bacteriën-bevattende phagosomes is de subcellular fractionering op sacharose stap verlopen18,20. Deze methode vereist echter meerdere centrifugeren stappen die kunnen leiden tot mechanische schade aan phagosomes, kunnen invloed hebben op de stabiliteit van de phagosomal componenten (eiwitten en lipiden) en tijdrovend is. Bovendien, het vereist het gebruik van een ultracentrifuge: een stuk van gespecialiseerde apparatuur die niet toegankelijk zijn voor elke laboratorium.
Onlangs, een nieuwe aanpak is toegepast op de isolatie van bacteriële-bevattende phagosomes, waarin de bacteriële pathogenen worden aangeduid met biotinyleerd lipopetide (Lipobiotin) en later geëxtraheerd met behulp van streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen21 . Wij stellen een alternatieve complementaire methode door het labelen van bacteriële oppervlakte amine-bevattende macromoleculen met NHS-Biotine gevolgd door daar-geconjugeerde magnetische kralen. Phagosomes volgens deze methode verkregen zijn hoogverrijkt in endosome en lysosoom markers en kunnen worden gebruikt voor een breed scala van tests, uit eiwit analyse omics analyse. Bovendien, vereist het geen gespecialiseerde apparatuur zoals ultracentrifuges. Bovendien, door het elimineren van de stappen van centrifugeren, zowel de mechanische schade aan phagosomes en de hoeveelheid tijd werkzaam zijn aanzienlijk kleiner zijn. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor de isolatie van de phagosomes met andere bacteriën, zoals de gram-positieve bacteriën Staphylococcus aureus, ook opgenomen in dit manuscript. Kortom, deze methode voor de isolatie van S. typhimurium-bevattende phagosomes is een eenvoudige, kosteneffectieve, en minder tijdrovend dan het klassieke isolement door sacharose verrijkt verloop-ultracentrifugatie, waardoor zeer phagosomes bacteriën bevatten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een nieuwe methode voor de isolatie van S. typhimurium-phagosomes bevattende coating van de bacteriën met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen wordt hier beschreven. Na de zachte verstoring van het celmembraan, kunnen bacteriën-bevattende phagosomes worden gemakkelijk gewonnen met behulp van een magnetische rek. We laten zien dat etikettering van de bacteriën de capaciteit van het pathogene agens oplevert behoudt voor het opwekken van ontsteking en niets aan de fagocytische eigenschap van…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in de Robinson’s lab wordt ondersteund door financiële middelen van Keulen Excellence Cluster op cellulaire Stress reacties in Aging-Associated ziekten, Universiteit van Keulen, Duitsland (CECAD; gefinancierd door de DFG binnen het Excellence-initiatief van de Duitse federale en staat regeringen) en subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln fortuin en Maria-Pesch Stichting van de Universiteit van Keulen, Duitsland.
Materials
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
Riferimenti
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
