Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi
Summary
Descriviamo qui un metodo semplice e rapido per l’isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina e streptavidina.
Abstract
Salmonella typhimurium è un batterio intracellulare facoltativo che causa gastroenterite in esseri umani. Dopo l’invasione della lamina propria, S. typhimurium batteri sono rapidamente rilevati e phagocytized da macrofagi e contenuti in vescicole conosciute come fagosomi al fine di essere degradato. Isolamento di S. typhimurium-fagosomi contenenti sono stati ampiamente usati per studiare come S. typhimurium infezione altera il processo di maturazione del fagosoma per impedire la degradazione batterica. Classicamente, l’isolamento di batteri contenenti fagosomi è stata eseguita da centrifugazione in gradiente di saccarosio. Tuttavia, questo processo richiede tempo e richiede attrezzature specializzate e un certo grado di destrezza. Qui descritto è un metodo semplice e rapido per l’isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina-streptavidina-coniugato biglie magnetiche. Fagosomi ottenuti con tale metodo possono essere sospeso in qualsiasi buffer di scelta, consentendo l’utilizzazione dell’isolato fagosomi per una vasta gamma di saggi, quali l’analisi della proteina, metabolita e dei lipidi. In sintesi, questo metodo per l’isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi è specifico, efficiente, rapida, richiede attrezzature minime ed è più versatile rispetto al classico metodo di isolamento di ultracentrifugazione gradiente di saccarosio.
Introduction
I macrofagi sono in circolazione le cellule fagocitiche specializzate che rilevare, inghiottono e degradano qualsiasi particella estranea presente nei tessuti periferici, che vanno da cellule apoptotiche a microrganismi come i batteri d’invasione. Al momento della rilevazione di recettore superficiale di marcatori specifici patogeni comunemente presenti sulla superficie dei microrganismi (noto come pattern molecolari associati o PAMPs), macrofagi avviare una riorganizzazione complessa della membrana cellulare in ordine per circondare e phagocytize l’ agente patogeno1.
L’agente patogeno tratta quindi è contenuto dal macrofago in una vescicola intracellulare conosciuto come fagosoma. Attraverso una serie di fusione e fissione eventi con altre vescicole come gli endosomi ed i lisosomi, contenenti patogeno phagosome acquisisce una serie di proteine necessarie per l’eliminazione del contenuto phagosomal. Pertanto, la composizione enzimatica di phagosome è altamente variabile nel corso di questo processo, noto come phagosome maturazione2.
Poco dopo la fagocitosi, il multimerici complessi vacuolar ATPasi (v-ATPasi) sono incorporato nella membrana del fagosoma da fusione con gli endosomi3. Questo complesso utilizza ATP ai protoni pompa dal cytosol al lumen del fagosoma4. L’acidificazione di phagosome è essenziale per gli eventi di fusione con altre vescicole5 e per l’attivazione di un gran numero di enzimi degradativi dipendente dal pH6. Un altro complesso enzimatico multimerici che è rapidamente assemblato sulla membrana phagosome è il complesso di NADPH-ossidasi (NOX). Complesso di NOX si ossida NADPH per la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) che sono secreti nel lume del fagosoma e che contribuiscono significativamente all’uccisione dei microrganismi tratta7.
Durante le fasi iniziali di maturazione, fagosomi presentano gli indicatori in genere quali Rab5 e Rab7 di endosomi precoci e tardivi, rispettivamente con la subunità di0 V dell’ v-ATPasi8. Fusione di fagosomi con i lisosomi e late endosomes risultati nell’esposizione dell’agente patogeno phagocytized a una vasta gamma di enzimi idrolitici come β-galattosidasi9, lipasi e proteasi catepsina. L’acidificazione del lume è inoltre necessario per l’attivazione di questi enzimi. Ad esempio, la scissione della catepsina D per produrre la forma breve attiva è dipendente dal pH10. Questi enzimi degradano l’agente patogeno e mediano la produzione dei peptidi corti patogeno-derivati che sono presentati da macrofagi di istocompatibilità (MHC) classe II molecole complesse alle cellule di T di innescare una risposta immunitaria adattativa11.
Quindi, la maturazione del fagosoma è cruciale per la risposta immunitaria innata e collega le braccia innate e adattativa del sistema immunitario. Non è una sorpresa che gli agenti patogeni hanno evoluto strategie per superare l’eliminazione dai macrofagi attraverso il processo di maturazione del fagosoma sopra descritte. Ad esempio, i batteri intracellulari tubercolosi del micobatterio e Legionella pneumophila impediscono la maturazione del fagosoma d’inibizione dell’Assemblea del v-atpasi e lume conseguente acidificazione12,13 . Altri batteri, come Listeria monocytogenes o Shigella flexneri inducono la formazione di pori nella membrana del fagosoma per scappare verso il citosol14,15. D’altra parte, Salmonella enterica sierotipo typhimurium (S. typhimurium) è in grado di modificare le proprietà di phagosome all’interno del vacuolo per trasformarla in un luogo adatto per sua replica16. Questa capacità rende S. typhimurium un modello molto interessante per studiare interferenza patogeno-mediata di maturazione del fagosoma.
S. typhimurium è un batterio intracellulare facoltativo che causa gastroenterite in esseri umani. Dopo l’invasione della lamina propria, S. Typhimurium batteri sono rapidamente rilevati phagocytized da macrofagi e contenuti all’interno di fagosomi17. Alcuni rapporti hanno descritto in precedenza che S. typhimurium-fagosomi contenenti presentano responsabili per sia gli endosomi ed i lisosomi18, e altri studi hanno trovato fusione fagosoma-lisosoma ha impedito al S. Typhimurium infezione19.
Inizialmente, maturazione di phagosome su S. l’infezione typhimurium è stato studiato da microscopia di immunofluorescenza. Lo sviluppo di tecniche per l’isolamento di batteri contenenti fagosomi attivato uno studio più accurato del contenuto phagosome in termini di indicatori endosoma e lisosoma. Ad oggi, il metodo principale utilizzato per l’isolamento di batteri contenenti fagosomi è il frazionamento subcellulare il saccarosio passo gradienti18,20. Tuttavia, questo metodo richiede più passaggi di centrifugazione che possono causare danni meccanici alla fagosomi, possono influenzare la stabilità dei componenti phagosomal (proteine e lipidi) e richiede molto tempo. Inoltre, si richiede l’utilizzo di un’ultracentrifuga: un pezzo di attrezzature specializzate che non sono accessibile per ogni laboratorio.
Recentemente, un nuovo approccio è stato applicato per l’isolamento di batteri contenenti fagosomi, in cui gli agenti patogeni batterici sono etichettati con biotinilati lipopetide (Lipobiotin) e successivamente estratte utilizzando streptavidina coniugata biglie magnetiche21 . Proponiamo un metodo alternativo e complementare di etichettatura batteriche superficiali contenenti macromolecole con NHS-biotina seguita da streptavidina coniugata biglie magnetiche. Fagosomi ottenuti con questo metodo sono altamente arricchiti in indicatori endosoma e lisosoma e possono essere utilizzati per un’ampia gamma di dosaggi, di analisi della proteina di omics analisi. Inoltre, non richiede attrezzature specializzate come ultracentrifughe. Inoltre, eliminando le fasi di centrifugazione, sia il danno meccanico al fagosomi e la quantità di tempo impiegata notevolmente sono ridotti. Questo metodo può essere facilmente adattato per l’isolamento di fagosomi contenenti altri batteri, come i batteri Gram-positivi Staphylococcus aureus, anche incluso in questo manoscritto. In sintesi, questo metodo per l’isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi è un semplice, conveniente, e meno tempo rispetto all’isolamento classica di saccarosio gradiente-ultracentrifugazione, rendering altamente arricchito fagosomi contenenti batteri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un nuovo metodo per l’isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi rivestendo i batteri con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata è descritto qui. Dopo la rottura della membrana cellulare delicata, fagosomi contenenti batteri possono essere facilmente estratte mediante un rack magnetico. Indichiamo che l’etichettatura dei batteri conserva la capacità dell’agente patogeno per indurre l’infiammazione e non altera la proprietà fagocitaria della cellula ospite. D’importanza, fagosomi ott…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ricerca nel laboratorio di Robinson è sostenuta da finanziamenti da Colonia Cluster di eccellenza sulle risposte di Stress cellulare nelle malattie di Aging-Associated, Università di Colonia, Germania (CECAD; finanziato dal DFG nell’ambito dell’iniziativa di eccellenza della Repubblica federale tedesco e Dichiari i governi) e sovvenzioni dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Fortuna Köln e Maria-Pesch Foundation dell’Università di Colonia, Germania.
Materials
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
Riferimenti
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
