Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager
Summary
Vi beskriver her en enkel og rask metode for isolering av Salmonella typhimurium-som inneholder phagosomes fra makrofager ved belegg bakterier med biotin og streptavidin.
Abstract
Salmonella typhimurium er en facultative intracellulær bakterie som forårsaker gastroenteritt hos mennesker. Etter invasjonen av lamina propria, S. Typhimurium bakterier er raskt oppdaget og phagocytized av makrofager, og finnes i blemmer kjent som phagosomes for å svekkes. Isolering av S. Typhimurium-som inneholder phagosomes mye brukt til å studere hvordan S. Typhimurium infeksjon endrer prosessen med phagosome modning å hindre bakteriell degradering. Klassisk, isolering av bakterier inneholder phagosomes er utført av sukrose gradient sentrifugering. Men denne prosessen er tidkrevende og krever spesialisert utstyr og en viss grad av fingerfølsomhet. Beskrevet her er en enkel og rask metode for isolering av S. Typhimurium-som inneholder phagosomes fra makrofager ved belegg bakterier med biotin-streptavidin-konjugerte magnetiske perler. Phagosomes ved denne metoden kan bli suspendert i en buffer for valg, tillater bruk av isolerte phagosomes for et bredt spekter av analyser, som protein, metabolitten og lipid analyse. I sammendraget, denne metoden for isolering av S. Typhimurium-som inneholder phagosomes er bestemt, effektiv, rask, krever minimum utstyr og er mer allsidig enn den klassiske metoden for isolasjon av sukrose forløpning-ultracentrifugation.
Introduction
Makrofager sirkulerer spesialiserte phagocytic celler som oppdage, sluker og svekke en utenlandsk partikkel tilstede i perifere vev, alt fra apoptotisk cellene til å invadere mikroorganismer som bakterier. På overflaten reseptor-mediert anerkjennelse av patogene bestemt markører vanligvis finnes på overflaten av mikroorganismer (kjent som patogen-forbundet molekylær mønster eller PAMPs), iverksette makrofager en omfattende omorganisering av mobilnettet membranen i for surround og phagocytize den patogen1.
Svelget lett patogen finnes deretter i macrophage i en intracellulær vesicle kalles phagosome. Gjennom en serie av fusjon og fisjon hendelser med andre blemmer som endosomes og lysosomer kjøper patogen inneholder phagosome et sett av proteiner kreves for eliminering av phagosomal innhold. Derfor er enzymatisk sammensetningen av phagosome svært variabel i løpet av denne prosessen, som kalles phagosome modning2.
Kort tid etter fagocytose, multimeric komplekse mer ATPase (v-ATPase) er innlemmet i phagosome membranen av fusjon med endosomes3. Dette anlegget benytter ATP å pumpe protoner fra stoffer til lumen av phagosome4. Forsuring av phagosome er avgjørende for fusion hendelser med andre blemmer5 og for aktivering av et stort antall pH-avhengig degradative enzymer6. En annen multimeric enzymatisk kompleks som er raskt montert på phagosome membranen er den NADPH-oxidase (NOX). NOX komplekse oxidizes NADPH for å produsere reaktive oksygen arter (ROS) som utskilles i phagosome lumen og som bidrar betydelig til drapet av svelget lett mikroorganismer7.
I de første trinnene i modning presentere phagosomes markører vanligvis som Rab5 og Rab7 for tidlige og sene endosomes henholdsvis sammen med V0 delenhet av v-ATPase8. Blanding av phagosomes med lysosomer og sent endosomes fører eksponering for phagocytized patogen en rekke hydrolytisk enzymer som katepsin proteaser, lipases og β-galactosidase9. Forsuring av lumen er også nødvendig for aktivering av disse enzymene. For eksempel er spalting av katepsin D å produsere aktive kortformen pH-avhengig10. Disse enzymene fornedre patogen og megle produksjon av patogen-avledet kort peptider som presenteres av macrophage store histocompatibility kompleks (MHC) klasse II molekylene T celler å utløse en adaptiv immunrespons11.
Derfor phagosome modning er avgjørende for medfødte immunforsvaret og linker medfødte og adaptive armene av immunsystemet. Det er ingen overraskelse at patogener har utviklet seg strategier for å overvinne eliminering av makrofager gjennom ovenfor beskrevet phagosome modning. For eksempel hindre intracellulære bakterier Mycobacterium tuberculosis og Legionella pneumophila phagosome modning av hemme v-ATPase montering og påfølgende lumen forsuring12,13 . Andre bakterier som Listeria monocytogenes eller Shigella flexneri skape pore i phagosome membranen å flykte i stoffer14,15. På den annen siden, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) er kjøpedyktig endre egenskapene for phagosome i vacuole å transformere det til et egnet sted for sin replikering16. Denne evnen gjør S. typhimurium en veldig interessant modell for å studere patogen-mediert forstyrrelser av phagosome modning.
S. typhimurium er en facultative intracellulær bakterie som forårsaker gastroenteritt hos mennesker. Etter invasjonen av lamina propria, S. Typhimurium bakterier er raskt oppdaget og phagocytized av makrofager, og finnes i phagosomes17. Enkelte rapporter har tidligere beskrevet at S. Typhimurium-som inneholder phagosomes presentere beslutningstakere for både endosomes og lysosomer18og andre studier har funnet phagosome-lysosome fusion forhindret på S. Typhimurium infeksjon19.
I utgangspunktet phagosome modning på S. Typhimurium infeksjon har blitt undersøkt av immunofluorescence mikroskopi. Utvikling av teknikker for isolering av bakterier inneholder phagosomes aktivert en mer nøyaktig studie av phagosome innholdet i markører endosome og lysosome. Til dags dato, den viktigste metoden brukes for isolering av bakterier inneholder phagosomes er det subcellular fraksjoneres på sakkarose trinnet graderinger18,20. Denne metoden krever imidlertid flere sentrifugering trinn som kan forårsake mekanisk skade phagosomes, kan påvirke stabiliteten av phagosomal komponenter (proteiner og lipider) og tidkrevende. Dessuten, det krever bruk av en ultracentrifuge: spesialisert utstyr som ikke er tilgjengelig for hvert laboratorium.
Nylig en ny tilnærming er utlignet mot isolasjon av bakteriell inneholder phagosomes, der bakteriell patogener er merket med biotinylated lipopetide (Lipobiotin) og senere utdraget benytter streptavidin-konjugerte magnetiske perler21 . Vi foreslå en alternativ komplementære metode ved merking bakteriell overflaten Amin inneholder makromolekyler med NHS-Biotin etterfulgt av streptavidin-konjugerte magnetiske perler. Phagosomes ved denne metoden er høyanriket i endosome og lysosome indikatorer og kan brukes for et bredt spekter av analyser, fra protein analyse til omics analyse. I tillegg krever den ikke spesialisert utstyr som ultracentrifuges. Videre ved å eliminere punktene sentrifugering, er både mekaniske skader på phagosomes og tiden ansatt betydelig redusert. Denne metoden kan lett tilpasses for isolering av phagosomes som inneholder andre bakterier, som de Gram-positive gule stafylokokker, også inkludert i dette manuskriptet. I sammendraget, denne metoden for isolering av S. Typhimurium-som inneholder phagosomes er en enkel, kostnadseffektiv, og mindre tidkrevende enn klassisk isolasjon av sukrose forløpning-ultracentrifugation, gjengivelse svært beriket bakterier inneholder phagosomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
En ny metode for isolering av S. Typhimurium-som inneholder phagosomes av belegg bakterier med biotin og streptavidin-konjugerte magnetiske perler er beskrevet her. Etter milde avbrudd av cellemembranen, kan bakterier inneholder phagosomes lett ut med en magnetisk rack. Vi viser at merking av bakterier bevarer kapasiteten av patogen å indusere betennelse og endrer ikke egenskapen phagocytic vert cellen. Viktigere, phagosomes ved denne metoden er beriket bakterier og endosome/lysosome indikatorer og blo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning på Robinson’s lab støttes av finansiering fra Köln Excellence klynge på mobilnettet stressresponser i Aging-Associated sykdommer, Universitetet i Köln, Tyskland (CECAD, finansiert av DFG innen Excellence initiativ fra tysk federal og statsmyndigheter) og tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670) og Köln formue Maria-dette grunnlaget for universitetet i Köln, Tyskland.
Materials
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
Riferimenti
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
