Descriviamo qui un metodo semplice e rapido per l'isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina e streptavidina.
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Articolo metodologico
Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Salmonella typhimurium è un batterio intracellulare facoltativo che causa gastroenterite in esseri umani. Dopo l'invasione della lamina propria, S. typhimurium batteri sono rapidamente rilevati e phagocytized da macrofagi e contenuti in vescicole conosciute come fagosomi al fine di essere degradato. Isolamento di S. typhimurium-fagosomi contenenti sono stati ampiamente usati per studiare come S. typhimurium infezione altera il processo di maturazione del fagosoma per impedire la degradazione batterica. Classicamente, l'isolamento di batteri contenenti fagosomi è stata eseguita da centrifugazione in gradiente di saccarosio. Tuttavia, questo processo richiede tempo e richiede attrezzature specializzate e un certo grado di destrezza. Qui descritto è un metodo semplice e rapido per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina-streptavidina-coniugato biglie magnetiche. Fagosomi ottenuti con tale metodo possono essere sospeso in qualsiasi buffer di scelta, consentendo l'utilizzazione dell'isolato fagosomi per una vasta gamma di saggi, quali l'analisi della proteina, metabolita e dei lipidi. In sintesi, questo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi è specifico, efficiente, rapida, richiede attrezzature minime ed è più versatile rispetto al classico metodo di isolamento di ultracentrifugazione gradiente di saccarosio.
Introduzione
I macrofagi sono in circolazione le cellule fagocitiche specializzate che rilevare, inghiottono e degradano qualsiasi particella estranea presente nei tessuti periferici, che vanno da cellule apoptotiche a microrganismi come i batteri d'invasione. Al momento della rilevazione di recettore superficiale di marcatori specifici patogeni comunemente presenti sulla superficie dei microrganismi (noto come pattern molecolari associati o PAMPs), macrofagi avviare una riorganizzazione complessa della membrana cellulare in ordine per circondare e phagocytize l' agente patogeno1.
L'agente patogeno tratta quindi è contenuto dal m....
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Protocollo
tutti i passaggi che implicano l'uso di patogeni S. typhimurium deve essere eseguito in un BSL-2 o maggiore sicurezza biologica livello struttura. La cultura e la spalmatura di S. Typhimurium, come pure l'infezione dei macrofagi derivate da midollo osseo (BMDMs) deve essere eseguita sotto cappa a flusso laminare per prevenire la contaminazione. L'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi può essere eseguita su qualsiasi banco di laboratorio BSL-2.
l'estrazione del midollo osseo da topi per relativa differenziazione in macrofagi è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzion....
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Risultati
Isolamento di batteri contenenti fagosomi dal presente protocollo richiede il biotinylation dei batteri come un primo passo. Quindi abbiamo valutato l'efficacia di S. typhimurium biotinylation dall'analisi di microscopia confocal di BMDMs infettato biotinilati mCherry -S. typhimurium etichettato con Cy5-streptavidina. Brevemente, BMDMs sono stati infettati come descritto in questo protocollo con mCherry -S. typhimurium precedentemente .......
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Discussione
Un nuovo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi rivestendo i batteri con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata è descritto qui. Dopo la rottura della membrana cellulare delicata, fagosomi contenenti batteri possono essere facilmente estratte mediante un rack magnetico. Indichiamo che l'etichettatura dei batteri conserva la capacità dell'agente patogeno per indurre l'infiammazione e non altera la proprietà fagocitaria della cellula ospite. D'importanza, fagosomi ottenu.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ricerca nel laboratorio di Robinson è sostenuta da finanziamenti da Colonia Cluster di eccellenza sulle risposte di Stress cellulare nelle malattie di Aging-Associated, Università di Colonia, Germania (CECAD; finanziato dal DFG nell'ambito dell'iniziativa di eccellenza della Repubblica federale tedesco e Dichiari i governi) e sovvenzioni dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Fortuna Köln e Maria-Pesch Foundation dell'Università di Colonia, Germania.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| EZ-Link NHS Biotina | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| TUBI | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Saccarosio | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitolo | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Citocalasina B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL o DynaMag Magnete | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spettrofotometro | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Ansa batterica (10µ l) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Sierotipo di Salmonella enterica Typhimurium SL1344 | Istituto Leibniz DSMZ-Collezione tedesca di microrganismi e colture | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidina Invitrogen | SA1011 | ||
| anticorpo anti-beta-actina | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anticorpo anti-mCherry | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anticorpo anti-Rab5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anticorpo anti-Rab7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPasi (V0) anticorpo | Santa Cruz | Biotechnology sc-28801 | |
| anticorpo anti-v-ATPasi (V1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anticorpo anti-catepsina D | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anticorpo anti-Tomm20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anticorpo anti-calnexina | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anticorpo anti-GAPDH | Santa Cruz Biotechnology | SC-20357 |
Riferimenti
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-79....
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Ristampe e permessi
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