Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager
Summary
Vi beskriver her en enkel og hurtig metode til isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende phagosomes fra makrofager ved belægning bakterier med biotin og streptavidin.
Abstract
Salmonella typhimurium er en fakultativ intracellulær bakterie, der forårsager gastroenteritis hos mennesker. Efter invasionen af lamina propria, S. typhimurium bakterier er hurtigt opdaget og phagocytized af makrofager, og indeholdt i vesikler kendt som phagosomes for at blive nedbrudt. Dyrkning af S. typhimurium-indeholdende phagosomes har været meget anvendt til at undersøge hvordan S. typhimurium infektion ændrer proces phagosome modningsproces at forhindre bakteriel nedbrydning. Klassisk, dyrkning af bakterier-holdige phagosomes er udført af saccharose gradient centrifugering. Men denne proces er tidskrævende, og kræver specialiseret udstyr og en vis smidighed. Beskrevet her er en enkel og hurtig metode til isolering af S. typhimurium-indeholdende phagosomes fra makrofager ved belægning bakterier med biotin-streptavidin-konjugeret magnetiske perler. Phagosomes opnået ved denne metode kan suspenderes i en buffer af valg, så udnyttelsen af isolerede phagosomes for en bred vifte af assays, såsom protein, metabolit, og lipid analyse. I Resumé, denne metode til dyrkning af S. typhimurium-indeholdende phagosomes er konkrete, effektive, hurtige, kræver minimum udstyr, og er mere alsidige end den klassiske metode til isolation af saccharose gradient-ultracentrifugering.
Introduction
Makrofager cirkulerer specialiserede fagocyterende celler, der registrerer, opsluge og nedbryde enhver udenlandsk partikel stede i perifere væv, lige fra apoptotiske celler til invaderende mikroorganismer såsom bakterier. På overfladen receptor-medieret anerkendelse af patogenet specifikke markører ofte er til stede på overfladen af mikroorganismer (kendt som patogen-associeret molekylære mønstre eller PAMPs), indlede makrofager en kompleks reorganisering af cellulære membran i ordre til surround og phagocytize patogen1.
Engulfed patogenet findes derefter af makrofager i en intracellulær vesikel, kaldet phagosome. Gennem en serie af fusion og fission arrangementer med andre vesikler som endosomes og lysosomer erhverver patogen-holdige phagosome et sæt af proteiner kræves for afskaffelse af phagosomal indhold. Derfor, den enzymatiske sammensætning af phagosome er meget varierende i løbet af denne proces, kaldet phagosome modning2.
Kort efter fagocytose, multimeriske komplekse vakuolære ATPase (v-ATPase) er indarbejdet i phagosome membran ved fusion med endosomes3. Dette kompleks udnytter ATP at pumpe protoner fra cytosol til lumen af phagosome4. Forsuring af phagosome er afgørende for hændelserne fusion med andre vesikler5 og aktivering af et stort antal pH-afhængige degradative enzymer6. En anden multimeriske enzymatisk kompleks, der er hurtigt samlet på phagosome membran er NADPH-oxidase (NOX) kompleks. NOX komplekse oxiderer NADPH for at producere reaktive ilt arter (ROS) der udskilles i phagosome lumen og at bidrage væsentligt til drabet på opslugte mikroorganismer7.
Under de indledende trin i modning præsentere phagosomes markører typisk som Rab5 og Rab7 af tidlige og sene endosomes henholdsvis sammen med V0 underenhed af v-ATPase8. Fusion af phagosomes med lysosomer og sen endosomes resulterer i phagocytized patogenet eksponering for en bred vifte af hydrolytiske enzymer såsom cathepsin proteaser, lipaser og β-galactosidase9. Forsuring af lumen er også nødvendigt for aktivering af disse enzymer. For eksempel, er spaltning af cathepsin D til at producere aktive kort form pH-afhængige10. Disse enzymer nedbrydes patogenet og mægle produktion af patogen-afledte kort peptider, der præsenteres af makrofag store histocompatibility complex (MHC) klasse II molekyler til T-celler til at udløse en adaptive immunrespons11.
Dermed phagosome modning er afgørende for det medfødte immunforsvar og links innat og adaptiv armene af immunsystemet. Det er ingen overraskelse, at patogener har udviklet strategier til at overvinde eliminering af makrofager gennem de ovenfor beskrevne proces af phagosome modning. For eksempel, forhindre de intracellulære bakterier Mycobacterium tuberculosis og Legionella pneumophila phagosome modning af hæmmende v-ATPase forsamling og deraf følgende lumen forsuring12,13 . Andre bakterier såsom Listeria monocytogenes eller Shigella flexneri fremkalde pore dannelse i phagosome membranen at flygte ind i cytosol14,15. På anden side, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) er i stand til at ændre egenskaberne af phagosome i vacuole at omdanne det til et egnet sted for replikering16. Denne evne gør S. typhimurium en meget interessant model til at studere patogen-medieret indblanding af phagosome modning.
S. typhimurium er en fakultativ intracellulær bakterie, der forårsager gastroenteritis hos mennesker. Efter invasionen af lamina propria, S. Typhimurium bakterier er hurtigt opdaget og phagocytized af makrofager, og indeholdt i phagosomes17. Nogle rapporter har tidligere beskrevet S. typhimurium-indeholdende phagosomes præsentere beslutningstagere for både endosomes og lysosomer18, og andre undersøgelser har fundet phagosome-lysosomet fusion forhindret ved S. Typhimurium infektion19.
I første omgang phagosome modning på S. typhimurium infektion har været undersøgt ved immunfluorescens mikroskopi. Udviklingen af teknikker til dyrkning af bakterier-holdige phagosomes aktiveret en mere nøjagtig undersøgelse af phagosome indhold i form af endosome og lysosomet markører. Til dato, den vigtigste metode anvendes til isolering af bakterier-holdige phagosomes er subcellulært fraktionering saccharose trin forløb18,20. Denne metode kræver imidlertid flere centrifugering trin, der kan forårsage mekaniske skader på phagosomes, kan påvirke stabiliteten af phagosomal komponenter (proteiner og lipider) og er tidskrævende. Desuden, det kræver brug af en ultracentrifuge: et stykke af specialiseret udstyr, der ikke er tilgængeligt for hvert laboratorium.
For nylig, en ny tilgang er blevet anvendt til isolering af bakteriel-holdige phagosomes, hvori bakterielle patogener er mærket med biotinylated lipopetide (Lipobiotin) og senere udvundet ved hjælp af streptavidin-konjugeret magnetiske perler21 . Vi foreslår en alternativ supplerende metode af mærkning bakteriel overflade Amin-holdige makromolekyler med NHS-Biotin efterfulgt af streptavidin-konjugeret magnetiske perler. Phagosomes opnået ved denne metode er stærkt beriget i endosome og lysosomet markører og kan bruges til en bred vifte af assays, fra proteinanalyse omik analyse. Derudover, kræver det ikke specialiseret udstyr såsom Ultracentrifuger. Desuden ved at fjerne centrifugering skridt, er både den mekaniske skader på phagosomes og den tid ansat betydeligt reduceret. Denne metode kan tilpasses nemt til isolering af phagosomes indeholdende andre bakterier, såsom Gram-positive Staphylococcus aureus, også medtaget i dette håndskrift. I Resumé, denne metode til dyrkning af S. typhimurium-indeholdende phagosomes er en enkel, omkostningseffektivt og mindre tidskrævende end den klassiske isolation af saccharose gradient-ultracentrifugering, rendering højt beriget bakterier-holdige phagosomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
En ny metode til dyrkning af S. typhimurium-indeholdende phagosomes af belægning bakterier med biotin og streptavidin-konjugeret magnetiske perler er beskrevet her. Efter blid afbrydelse af cellemembranen, kan bakterier-holdige phagosomes nemt udtrækkes ved hjælp af en magnetisk rack. Vi viser, at mærkning af bakterier bevarer patogenet evne til at fremkalde betændelse og ændrer ikke egenskaben fagocyterende af cellen vært. Vigtigere, phagosomes opnået ved denne metode er beriget med bakterier o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Robinson’s lab er støttet af midler fra Köln Excellence klynge på cellulært Stress respons i Aging-Associated sygdomme, universitetet i Köln, Tyskland (CECAD, finansieret af DFG inden for Excellence initiativ af det tyske føderale og staten regeringer) og tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln formue og Maria-Pesch fundament af universitetet i Köln, Tyskland.
Materials
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
Riferimenti
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
