Summary

Modelo murino de inflamación inducida por Pentylenetetrazole

Published: June 12, 2018
doi:

Summary

Este protocolo describe un método de química inflamación con pentylenetetrazole y proporciona un modelo de ratón de la epilepsia. Este protocolo también puede utilizarse para investigar la vulnerabilidad a la inducción de convulsiones y de la patogenesia después de las crisis epilépticas en los ratones.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) es un antagonista del receptor GABA-A. La inyección intraperitoneal de PTZ en un animal induce una convulsión aguda, severa a una dosis alta, mientras que las inyecciones secuenciales de una dosis de subconvulsive se han utilizado para el desarrollo de la química, Yesca, un modelo de epilepsia. Una sola inyección de dosis bajas de PTZ induce una convulsión leve sin convulsión. Sin embargo, repetidas inyecciones de dosis bajas de PTZ disminuyen el umbral para evocar un ataque convulsivo. Por último, la administración continua de dosis bajas de PTZ induce una severa convulsión tónico-clónica. Este método es simple y ampliamente aplicable a investigar la patofisiología de la epilepsia, que se define como una enfermedad crónica que involucra convulsiones repetitivas. Este producto químico Yesca protocolo causa convulsiones repetitivas en animales. Con este método, se estimó la vulnerabilidad a ataques de PTZ-mediada o el grado de agravación de las crisis epilépticas. Estas ventajas han llevado a la utilización de este método para la detección de drogas antiepilépticas y genes relacionados con la epilepsia. Además, este método se ha utilizado para investigar daño neuronal después de ataques epilépticos debido a los cambios histológicos observados en los cerebros de pacientes epilépticos también aparecen en los cerebros de animales encendido química. Así, este protocolo es útil para la producción conveniente de modelos animales de epilepsia.

Introduction

La epilepsia es un trastorno neurológico crónico que se caracteriza por convulsiones recurrentes y afecta aproximadamente al 1% de las personas. Los mecanismos subyacentes de generación epileptogénesis y convulsiones en pacientes con epilepsia no pueden ser totalmente clarificados en estudios clínicos. Por lo tanto, un modelo animal apropiado es necesario para el estudio de la epilepsia1.

Una gran variedad de modelos animales de epilepsia se han utilizado para investigar la fisiología de la epilepsia y para identificar los fármacos antiepilépticos2,3. Entre estos modelos, la inducción de convulsiones farmacológicas es un método común utilizado para generar un modelo animal para la investigación de la patología de la epilepsia4. Este método es barato y simple. Inflamación mediada por electrodo es también un método comúnmente utilizado, pero los costos de este procedimiento son más altos, y el método requiere habilidades quirúrgicas y eléctricos para inducir convulsiones repetitivas5.

Inducción farmacológica también es ventajosa porque el tiempo y el número de convulsiones se controlan fácilmente. Modelos de ratón genético que presentan convulsiones espontáneas también se utilizan en el estudio de la epilepsia. Sin embargo, la predicción de Cuándo y con qué frecuencia las convulsiones se presentan en estos modelos genéticos puede ser imposible6. Un sistema de seguimiento es necesario para observar el comportamiento epiléptico de ratones modificados genéticamente6.

Ácido kaínico, la pilocarpina y la pentylenetetrazole (PTZ) son ampliamente utilizados como inductores de incautación drogas7. El Ácido kaínico es un agonista de los receptores de glutamato, y pilocarpina activa los receptores colinérgicos. PTZ es un ácido gamma aminobutírico (GABA)-un antagonista del receptor del8. PTZ suprime la función de las sinapsis inhibitorias, una mayor actividad neuronal. Presente Reglamento causa asimientos generalizados en animales9. Una sola inyección de Ácido kaínico y pilocarpina puede inducir convulsiones agudas, especialmente status epiléptico (SE)10,11 y kaínico ácido o pilocarpina-mediada SE promueve crónica espontánea y recurrente asimientos12 , 13. las grabaciones electroencephalographic (EEG) y análisis de la conducta han indicado que las crisis recurrentes espontáneas se observan un mes después de una sola inyección12,13. Una sola inyección de una dosis convulsiva de PTZ también induce crisis aguda. Sin embargo, asimientos crónicos espontáneos después de una inyección única de PTZ son difíciles de promover. La administración crónica de PTZ es necesaria para inducir convulsiones repetitivas14. En cualquiera de los métodos, la generación de convulsiones repetitivas es capaz de inducir una patología más similar a la de la epilepsia humana que la generación de convulsiones agudas. En el caso de PTZ, cada inyección evoca una convulsión, y severidad de la crisis se convierte en más grave en una manera paso a paso con cada inyección. Por último, una sola inyección de PTZ de dosis bajas induce una severa convulsión tónico-clónica. En esta fase, cada inyección evoca las convulsiones severas. Además, la latencia de la convulsión y la duración también cambian en el transcurso de las inyecciones. La latencia a asimiento tónico se convierte a menudo más corta en esta última fase de inflamación15. Además, agravamiento de la convulsión se acompaña de una convulsión prolongada duración16. Investigar el mecanismo molecular que regula la gravedad de la crisis, latencia y duración es útil para la detección de drogas antiepilépticas17,18,19.

Comúnmente los asimientos son inducidos por una sola administración sistémica de PTZ y la recuperación es muy rápida, dentro de 30 min4,5. Así, el número de las convulsiones es más controlable en el modelo PTZ-astillas. Sin embargo, la supervisión de EEG ha indicado que pueden verse picos generalizadas hasta 12 h después de PTZ-medió incautación20. Por lo tanto, los animales preferiblemente deben permanecer bajo observación durante 24 h después de las convulsiones mioclónicas o tónico21 para análisis más preciso de los mecanismos de inflamación.

La administración de los fármacos antiepilépticos, como la etosuximida, valproato, fenobarbital, vigabatrina y retigabine3, antes o después de la inyección de PTZ mitiga el agravamiento de la convulsión severidad3,22, 23. Asimismo, ratones knockout que falta genes implicados en la exacerbación de convulsiones, como matriz metaloproteinasa-924,25 y neuritin FGF-2226, han demostrado exhibir convulsiones reducida gravedad después de inyecciones múltiples de PTZ. Además, observando alteraciones histopatológicas después de las crisis epilépticas es posible con este método. En pacientes con epilepsia del lóbulo temporal, hay cambios histológicos típicos en el cerebro, como la fibra musgosa brotación27,28, gránulo anormal neurona migración29, astrogliosis30, células neuronales muerte en el hipocampo31,32y esclerosis hipocampal33. Cambios similares se observan en animales epilépticos modelo. Entre los métodos disponibles, inflamación química mediada por PTZ es un método bueno, reproducible y barato para producir un modelo animal de epilepsia. En un modelo SE mediada por pilocarpina, control de las convulsiones es difícil y muchos ratones mueren o no a desarrollar SE34. En contraste, la mortalidad y la gravedad de la crisis son más controlables en el modelo PTZ. Además, PTZ es menos costoso que el Ácido kaínico y habilidades en cirugía de cerebro de ratón no son necesarios para la administración de la droga.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el cuidado Animal y uso de la Tokyo Metropolitan Instituto de ciencias médicas. 8 postnatal – ratones de 16 semanas de edad se recomiendan. Cualquier cepa consanguínea es aceptable para el experimento. Ratones C57BL/6 son más resistentes a PTZ, que ratones albinos BALB/c y Suiza son más sensibles a PTZ. C57BL/6 fueron utilizados en este estudio. Vulnerabilidad a PTZ también depende de la edad del ratón. En comparación con ratones pequeños, ratones más …

Representative Results

Inyección repetitiva de PTZ induce un aumento en la severidad de convulsiones. Seis ratones C57BL/6 fueron tratados con PTZ, y otro 6 ratones fueron tratados con solución salina como grupo de control. La dosis PTZ fue de 35 mg/kg, y 10 inyecciones fueron administradas. La puntuación de ataque aumentó gradualmente con inyecciones de PTZ, considerando que no hay ataques o comportamientos anormales fueron evocados por las inyecciones de solución Salinas (figura 2</s…

Discussion

Aquí, presentamos un protocolo ampliamente accesible para el establecimiento de un modelo farmacológico de la epilepsia. Inflamación química mediada por PTZ tiene una larga historia y es un modelo comúnmente aceptado para el estudio de la patología celular y la histopatología de epilepsia41. El modelo de inflamación química de la epilepsia ha sido revisado previamente por Suzdak y Jansen, 199542. Inducción de convulsiones farmacológicas, especialmente con PTZ, es…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado en parte por números de concesión JSPS KAKENHI 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536 y 17 K 07086, números de concesión MEXT KAKENHI 25110737 y 23110525, AMED concesión número JP18ek0109311 y la Fundación de investigación médica de un y el Japón Fundación de investigación de la epilepsia.

Materials

Pentylenetetrazole Sigma-Aldrich P6500
Sodium chloride MANAC 7647-14-5
Mouse CLEA Japan C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL) Terumo SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm) Terumo NN-2719S
Weighing scale Mettler PE2000 This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Sodium hydroxide nacalai tesque 31511-05
Peristatic pump ATTO SJ1211
Sucrose nacalai tesque 30404-45
Microtome Yamato REM-700 This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade Feather S35
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
anti-synaptoporin antibody Synaptic systems 102 002
anti-ZnT3 antibody Synaptic systems 197 002
anti-doublecortin Santa Cruz sc-8066 This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus O'hara
Three chamber test apparatus Muromachi

Riferimenti

  1. Löscher, W., Brandt, C. Prevention or Modification of Epileptogenesis after Brain Insults: Experimental Approaches and Translational Research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
  2. Loscher, W. Animal Models of Seizures and Epilepsy: Past, Present, and Future Role for the Discovery of Antiseizure Drugs. Neurochem Res. , (2017).
  3. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  4. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  5. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. . Models of Seizures and Epilepsy. , xvii (2006).
  6. Yang, Y., Frankel, W. N. Genetic approaches to studying mouse models of human seizure disorders. Adv Exp Med Biol. 548, 1-11 (2004).
  7. Leite, J. P., Garcia-Cairasco, N., Cavalheiro, E. A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Res. 50 (1-2), 93-103 (2002).
  8. Squires, R. F., Saederup, E., Crawley, J. N., Skolnick, P., Paul, S. M. Convulsant potencies of tetrazoles are highly correlated with actions on GABA/benzodiazepine/picrotoxin receptor complexes in brain. Life Sci. 35 (14), 1439-1444 (1984).
  9. Tourov, A., et al. Spike morphology in PTZ-induced generalized and cobalt-induced partial experimental epilepsy. Funct Neurol. 11 (5), 237-245 (1996).
  10. Furtado Mde, A., Braga, G. K., Oliveira, J. A., Del Vecchio, F., Garcia-Cairasco, N. Behavioral, morphologic, and electroencephalographic evaluation of seizures induced by intrahippocampal microinjection of pilocarpine. Epilepsia. 43, 37-39 (2002).
  11. Hosford, D. A. Animal models of nonconvulsive status epilepticus. J Clin Neurophysiol. 16 (4), 306-313 (1999).
  12. Medina-Ceja, L., Pardo-Pena, K., Ventura-Mejia, C. Evaluation of behavioral parameters and mortality in a model of temporal lobe epilepsy induced by intracerebroventricular pilocarpine administration. Neuroreport. , (2014).
  13. Bragin, A., Azizyan, A., Almajano, J., Wilson, C. L., Engel, J. Analysis of chronic seizure onsets after intrahippocampal kainic acid injection in freely moving rats. Epilepsia. 46 (10), 1592-1598 (2005).
  14. Schmidt, J. Changes in seizure susceptibility in rats following chronic administration of pentylenetetrazol. Biomed Biochim Acta. 46 (4), 267-270 (1987).
  15. Angelatou, F., Pagonopoulou, O., Kostopoulos, G. Changes in seizure latency correlate with alterations in A1 adenosine receptor binding during daily repeated pentylentetrazol-induced convulsions in different mouse brain areas. Neuroscience Letters. 132 (2), 203-206 (1991).
  16. Löscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 50 (1), 105-123 (2002).
  17. Ilhan, A., Iraz, M., Kamisli, S., Yigitoglu, R. Pentylenetetrazol-induced kindling seizure attenuated by Ginkgo biloba extract (EGb 761) in mice. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 30 (8), 1504-1510 (2006).
  18. Emami, S., Kebriaeezadeh, A., Ahangar, N., Khorasani, R. Imidazolylchromanone oxime ethers as potential anticonvulsant agents: Anticonvulsive evaluation in PTZ-kindling model of epilepsy and SAR study. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (2), 655-659 (2011).
  19. Klitgaard, H. Levetiracetam: The Preclinical Profile of a New Class of Antiepileptic Drugs?. Epilepsia. 42, 13-18 (2001).
  20. Kellinghaus, C., et al. Dissociation between in vitro and in vivo epileptogenicity in a rat model of cortical dysplasia. Epileptic Disord. 9 (1), 11-19 (2007).
  21. Koutroumanidou, E., et al. Increased seizure latency and decreased severity of pentylenetetrazol-induced seizures in mice after essential oil administration. Epilepsy Res Treat. 2013, 532657 (2013).
  22. Krall, R. L., Penry, J. K., White, B. G., Kupferberg, H. J., Swinyard, E. A. Antiepileptic drug development: II. Anticonvulsant drug screening. Epilepsia. 19 (4), 409-428 (1978).
  23. White, H. S. Preclinical development of antiepileptic drugs: past, present, and future directions. Epilepsia. 44, 2-8 (2003).
  24. Mizoguchi, H., et al. Matrix metalloproteinase-9 contributes to kindled seizure development in pentylenetetrazole-treated mice by converting pro-BDNF to mature BDNF in the hippocampus. J Neurosci. 31 (36), 12963-12971 (2011).
  25. Lee, C. H., Umemori, H. Suppression of epileptogenesis-associated changes in response to seizures in FGF22-deficient mice. Front Cell Neurosci. 7, 43 (2013).
  26. Shimada, T., Yoshida, T., Yamagata, K. Neuritin Mediates Activity-Dependent Axonal Branch Formation in Part via FGF Signaling. J Neurosci. 36 (16), 4534-4548 (2016).
  27. Parent, J. M., et al. Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci. 17 (10), 3727-3738 (1997).
  28. Sutula, T., He, X. X., Cavazos, J., Scott, G. Synaptic reorganization in the hippocampus induced by abnormal functional activity. Science. 239 (4844), 1147-1150 (1988).
  29. Parent, J. M., Elliott, R. C., Pleasure, S. J., Barbaro, N. M., Lowenstein, D. H. Aberrant seizure-induced neurogenesis in experimental temporal lobe epilepsy. Ann Neurol. 59 (1), 81-91 (2006).
  30. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  31. Arzimanoglou, A., et al. Epilepsy and neuroprotection: an illustrated review. Epileptic Disord. 4 (3), 173-182 (2002).
  32. Represa, A., Niquet, J., Pollard, H., Ben-Ari, Y. Cell death, gliosis, and synaptic remodeling in the hippocampus of epileptic rats. Journal of Neurobiology. 26 (3), 413-425 (1995).
  33. Blumcke, I. Neuropathology of focal epilepsies: a critical review. Epilepsy Behav. 15 (1), 34-39 (2009).
  34. Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 102 (3), 153-159 (2012).
  35. Nokubo, M., et al. Age-dependent increase in the threshold for pentylenetetrazole induced maximal seizure in mice. Life Sci. 38 (22), 1999-2007 (1986).
  36. Ferraro, T. N., et al. Mapping Loci for Pentylenetetrazol-Induced Seizure Susceptibility in Mice. The Journal of Neuroscience. 19 (16), 6733-6739 (1999).
  37. Kosobud, A. E., Cross, S. J., Crabbe, J. C. Neural sensitivity to pentylenetetrazol convulsions in inbred and selectively bred mice. Brain Res. 592 (1-2), 122-128 (1992).
  38. Shimada, T., Takemiya, T., Sugiura, H., Yamagata, K. Role of Inflammatory Mediators in the Pathogenesis of Epilepsy. Mediators of Inflammation. 2014, 1-8 (2014).
  39. Itoh, K., et al. Magnetic resonance and biochemical studies during pentylenetetrazole-kindling development: the relationship between nitric oxide, neuronal nitric oxide synthase and seizures. Neuroscienze. 129 (3), 757-766 (2004).
  40. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
  41. Bialer, M., White, H. S. Key factors in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Nat Rev Drug Discov. 9 (1), 68-82 (2010).
  42. Suzdak, P. D., Jansen, J. A. A review of the preclinical pharmacology of tiagabine: a potent and selective anticonvulsant GABA uptake inhibitor. Epilepsia. 36 (6), 612-626 (1995).
  43. Seyfried, T. N., Glaser, G. H. A review of mouse mutants as genetic models of epilepsy. Epilepsia. 26 (2), 143-150 (1985).
  44. Upton, N., Stratton, S. Recent developments from genetic mouse models of seizures. Current Opinion in Pharmacology. 3 (1), 19-26 (2003).
  45. Rao, M. S., Hattiangady, B., Reddy, D. S., Shetty, A. K. Hippocampal neurodegeneration, spontaneous seizures, and mossy fiber sprouting in the F344 rat model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Res. 83 (6), 1088-1105 (2006).
  46. Hellier, J. L., Patrylo, P. R., Buckmaster, P. S., Dudek, F. E. Recurrent spontaneous motor seizures after repeated low-dose systemic treatment with kainate: assessment of a rat model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 31 (1), 73-84 (1998).
  47. Turski, L., et al. Seizures produced by pilocarpine: neuropathological sequelae and activity of glutamate decarboxylase in the rat forebrain. Brain Res. 398 (1), 37-48 (1986).
  48. Itoh, K., Watanabe, M. Paradoxical facilitation of pentylenetetrazole-induced convulsion susceptibility in mice lacking neuronal nitric oxide synthase. Neuroscienze. 159 (2), 735-743 (2009).
  49. Deng, Y., Wang, M., Wang, W., Ma, C., He, N. Comparison and Effects of Acute Lamotrigine Treatment on Extracellular Excitatory Amino Acids in the Hippocampus of PTZ-Kindled Epileptic and PTZ-Induced Status Epilepticus Rats. Neurochemical Research. 38 (3), 504-511 (2013).
  50. Kupferberg, H. Animal models used in the screening of antiepileptic drugs. Epilepsia. 42, 7-12 (2001).
  51. Berg, A. T., Plioplys, S. Epilepsy and autism: is there a special relationship?. Epilepsy Behav. 23 (3), 193-198 (2012).
  52. Robinson, S. J. Childhood epilepsy and autism spectrum disorders: psychiatric problems, phenotypic expression, and anticonvulsants. Neuropsychol Rev. 22 (3), 271-279 (2012).
  53. Tuchman, R. Autism and Cognition Within Epilepsy: Social Matters. Epilepsy Curr. 15 (4), 202-205 (2015).
  54. Takechi, K., Suemaru, K., Kiyoi, T., Tanaka, A., Araki, H. The alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptor modulates autism-like behavioral and motor abnormalities in pentylenetetrazol-kindled mice. Eur J Pharmacol. 775, 57-66 (2016).
  55. Abdel-Zaher, A. O., Farghaly, H. S. M., Farrag, M. M. Y., Abdel-Rahman, M. S., Abdel-Wahab, B. A. A potential mechanism for the ameliorative effect of thymoquinone on pentylenetetrazole-induced kindling and cognitive impairments in mice. Biomed Pharmacother. 88, 553-561 (2017).
  56. Jia, F., et al. Effects of histamine H(3) antagonists and donepezil on learning and mnemonic deficits induced by pentylenetetrazol kindling in weanling mice. Neuropharmacology. 50 (3), 404-411 (2006).
  57. Pahuja, M., Mehla, J., Reeta, K. H., Tripathi, M., Gupta, Y. K. Effect of Anacyclus pyrethrum on pentylenetetrazole-induced kindling, spatial memory, oxidative stress and rho-kinase II expression in mice. Neurochem Res. 38 (3), 547-556 (2013).

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Citazione di questo articolo
Shimada, T., Yamagata, K. Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model. J. Vis. Exp. (136), e56573, doi:10.3791/56573 (2018).

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