Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi
Summary
Fizyolojik açıdan önemli tümör microenvironment meme kanserinin fare modellerinde parametrelerinde değerlendirilmesi için düşük-alan (L-band, 1.2 GHz) elektron paramagnetic rezonans çözünür nitroxyl ve trityl sonda kullanarak gösterilmiştir.
Abstract
Bu iletişim kuralı düşük alan elektron paramagnetic rezonans (EPR) kapasitesini gösterir-kimyasal tümör microenvironment (TME), nicel bilgi sağlamak için fonksiyonel paramagnetic probları ile birlikte teknikleri dayalı dahil olmak üzere p O2, pH, redoks durum, interstisyel inorganik fosfat (PI) ve hücre içi glutatyon (GSH) konsantrasyonları. Özellikle, son zamanlarda geliştirilen çözünür çok fonksiyonlu trityl sonda bir uygulama eşsiz vivo içinde pH, pO2 ve Peşzamanlı ölçümler sağlar ben e xtracellular alanı (umut sonda). Üç parametre kullanarak tek bir sonda ölçümleri onların korelasyon analizleri için bağımsız soruşturma dağıtım ve ölçümlerin zaman izin verir.
Introduction
Kanser ilerlemesi ve tedavi TME önemli bir rol giderek takdir1‘ dir. TME solid tümör, doku hipoksi2, asidoz3,4, yüksek azalan bakiyeli kapasitesi5, hücre içi GSH6,7yüksek konsantrasyonları önemli fizyolojik parametreler arasında ve interstisyel Pi8 iyi belgelenmiş. Noninvaziv içinde vivo pO2, pH, Pi, GSH ve Redoks Değerlendirmeler TME biyolojik süreçlerinde benzersiz anlayışlar sağlamak ve anti-kanser ilaçlar ve tedavi stratejileri TME hedefli önceden klinik tarama için önceden araçları yardımı. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve düşük alan EPR tabanlı teknikleri dokularda makul Radyofrekans penetrasyon derinliği onları bu TME parametrelerin noninvaziv değerlendirme için en uygun yaklaşımlar yapar. MRI büyük ölçüde görüntüleme su proton dayanır ve klinik ayarlarında anatomik çözümlemesi sağlamak için yaygın olarak kullanılır ama fonksiyonel çözünürlük yoksun. Hücre dışı Pi konsantrasyon ve endojen fosfat bir sinyal dayalı pH fosfor-31 Nükleer manyetik rezonans (31P-NMR) ölçümleri TME karakterizasyonu için potansiyel olarak çekici ama normalde tarafından birkaç kez maskeli yüksek hücre içi Pi konsantrasyonları9,10. Bu, aksine EPR ölçümler spektroskopisinin üzerinde itimat ve görüntüleme, özel olarak tasarlanmış fonksiyonel çözünürlük sağlamak için paramagnetic sondalar. Eksojen EPR probları eksojen üzerinde bir avantaj var Not NMR EPR daha yüksek fazla içsel duyarlılık ve endojen arka plan EPR sinyalleri yokluğu nedeniyle sondalar. Bir çift işlevi pH ve Redoks nitroxyl son gelişmeler sonda11 ve çok fonksiyonlu trityl sonda12 eşzamanlı ölçümler birkaç TME parametrelerinin vivo içinde eşsiz fırsatlar sunuyor ve onların korelasyon analizleri bağımsız sonda dağıtım ve ölçüm saati. Bizim bilgi için başka yöntem aynı anda vivo içinde Fizyolojik açıdan önemli kimyasal TME parametreleri pO2, pHe, Pi, Redoks ve GSH gibi yaşayan bireylerde değerlendirmek için kullanılabilir vardır.
İçin probları Vivo Fonksiyonel ölçüleri:
Şekil 1 paramagnetic sondalar partikül ve çözünür probları dahil TME parametreleri erişmek için kullanılan kimyasal yapıları gösterir. Yüksek fonksiyonel hassasiyet, istikrar canlı dokuya ve en az toksisite partikül probları için in vivo EPR pulsoksimetre çözünür probları üzerinden tercih yapmak birkaç faydaları vardır. Örneğin, partikül probları doku implant bırakmak için doku pO2 boyuna ölçümü birkaç hafta içinde çözünür probları göre yerinde tutma kez artmıştır. Öte yandan, çözünür probları partikül probları EPR tabanlı teknikleri Imaging yanı sıra birden fazla işlevleri üzerinden eşlik eden analizler izin kullanarak ölçüleri uzamsal çözüldü sağlayarak daha iyi performans (pO2, faz, Pi, redoks, ve GSH).
Şekil 1. TME değerlendirme tahlil bir araya paramagnetic sondalar kimyasal yapılarının. Bu partikül pO2 sonda, LiNc BuO içerir (R = – O (CH2)3CH3) ve çözünür sondalar: Çift işlevi pH ve Redoks sonda, NR; GSH-duyarlı sonda, RSSR; ve çok fonksiyonlu pO2, pH ve hücre dışı microenvironment, umut sonda. probe Pi Bu sonda sentezi sağlanan başvuruları 11,12‘ tanımlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan yöntemler yani pO2, pH, redoks durumu ve interstisyel Pi ve hücre içi GSH konsantrasyonları kimyasal TME kritik parametreleri noninvaziv vivo içinde değerlendirilmesi için olanak sağlar. Manyetik rezonans teknikleri, MRI ve düşük alan EPR, gibi noninvaziv vivo içinde bu TME parametrelerinin profil oluşturma için seçtiğiniz yöntemlerdir. MRI anatomik yapıları görüntüler ama fonksiyonel duyarlılık yoksun. MRI aksine, EPR teknikleri fonksiyonel spin probl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen NIH tarafından desteklenen CA194013, CA192064 ve U54GM104942 verir. WVCTSI start-up VVK, AB, ve TDE için kabul edilmektedir. Yazarlar Dr. M. Gencheva ve K. Steinberger açıklayıcı deneyleri ile yardım için teşekkür ederiz. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| L-band EPR spectrometer | Magnettech, Germany | L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules | |
| Temperature & Gas Controller | Noxygen, Germany | Temperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition | |
| Sonicator | Fisher Scientific | ||
| GSH (L-Glutathione reduced) | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| MMTV-PyMT mice | In house | ||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Met-1 murine breast cancer cells | In house | ||
| C57Bl/6 wild type mice | Jackson Laboratory | ||
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypan Blue Exclusion Dye | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Ohmeda Fluotec 3 | |||
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott Laboratories | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic | sigma-Aldrich | S07051 | |
| Sodium Chloride | sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric acid | sigma-Aldrich | 320331 | |
| Sodium Hydroxide | sigma-Aldrich | S8045 | |
| Glucose | sigma-Aldrich | ||
| Glucose oxydase | sigma-Aldrich | ||
| Lauda Circulator E100 | Lauda-Brikmann | ||
| pH meter Orion | Thermo Scientific | ||
| LiNc-BuO probe | In house | The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13 | |
| NR probe | In house | The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11 | |
| RSSR probe | In house | The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15 | |
| HOPE probe | In house | The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12 |
Riferimenti
- Siemann, D. W. . Tumor Microenvironment. , (2011).
- Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
- Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).
- Haulica, A., Ababei, L. Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours. Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).
- Matsumoto, K., et al. High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).
- Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).
- Voegtlin, C., Thompson, J. W. Glutathione content of tumor animals. J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).
- Bobko, A. A., et al. Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression. Sci Rep. 7, 41233 (2017).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).
- Gade, T. P., et al. Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors. Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).
- Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques. JACS. 135, 5904-5910 (2013).
- Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
- Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models. Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).
- Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
- Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe. Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).
- Khramtsov, V. V., Zweier, J. L., Hicks, R. . Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , 537-566 (2010).
- Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment). Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).
- Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. . Practical NMR spectroscopy. , (1980).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Eubank, T. D., et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).
- Khramtsov, V. V., et al. Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method. Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).
- Komarov, D. A., et al. Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes. Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).
- Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin. Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).
- Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment. Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).
- Samouilov, A., et al. In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe. Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).
- Goodwin, J., et al. In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation. NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).
