في فيفو تقييم الجيش الشعبي الثوري لدرجة الحموضة، فس2، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات والجلوتاثيون في "ورم المكروية"
Summary
ويتجلى الحقل منخفضة (النطاق L، 1.2 جيجاهرتز) الإلكترون الرنين باراماجنيتيك استخدام المسابير نيتروكسيل وتريتيل للذوبان لتقييم البارامترات فسيولوجيا هاما في ورم المكروية في نماذج الماوس لسرطان الثدي.
Abstract
هذا البروتوكول يوضح قدرة إلكترون منخفضة-حقل باراماجنيتيك الرنين (EPR)-على أساس تقنيات في تركيبة مع تحقيقات باراماجنيتيك الوظيفية لتوفير معلومات كمية عن المواد الكيميائية وورم المكروية (TME)، بما في ذلك ف O2، الرقم الهيدروجيني، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات غير العضوية المتداخلة (Pi)، وداخل الخلايا الجلوتاثيون (المدفع جريازيف). على وجه الخصوص، يقدم طلبا للتحقيق مؤخرا نمواً ترتيل متعدد الوظائف القابلة للذوبان فرصة غير مسبوقة في فيفو قياسات متزامنة من فحو فس2 ففي ه إكستراسيلولار الفضائية (تحقيق الأمل). قياسات المعلمات الثلاث باستخدام مجس واحد تسمح بتحليلاتها العلاقة مستقلة عن توزيع المسبار والوقت للقياسات.
Introduction
دور رئيسي ل TME في تطور السرطان والعلاج هو تقدير متزايد1. بين المعلمات الفسيولوجية الهامة من TME في الأورام الصلبة، نقص الأنسجة2، الحماض3،4، عالية مما يقلل قدرة5، وتركيزات مرتفعة من داخل الخلايا المدفع جريازيف6،7، ومن خلالي Pi8 موثقة توثيقاً جيدا. تقييمات موسع المجراة في فس2ودرجة الحموضة وبي، والمدفع جريازيف والأكسدة والاختزال تقديم رؤى فريدة من نوعها في العمليات البيولوجية في TME، وتساعد أدوات مسبقة لفحص ما قبل السريرية للأدوية المضادة للسرطان، واستهدفت TME الاستراتيجيات العلاجية. عمق اختراق معقولة الترددات الراديوية في الأنسجة بالتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) والتقنيات المستندة إلى الجيش الشعبي الثوري منخفضة-ميدان يجعلها أنسب النهج لتقييم موسع لهذه المعلمات TME. التصوير بالرنين المغناطيسي تعتمد إلى حد كبير على تصوير المياه البروتونات ويستخدم على نطاق واسع في ظروف سريرية لتوفير دقة التشريحية لكنه يفتقر إلى قرار الفنية. يحتمل أن تكون جذابة لتوصيف TME قياسات الرنين المغناطيسي النووي الفوسفور-31 (31فالرنين المغناطيسي النووي) تركيز Pi خارج الخلية، ودرجة الحموضة استناداً إلى إشارة من الفوسفات الذاتية، ولكن يتم حجب عادة قبل عدة مرات أعلى داخل الخلايا Pi تركيزات9،10. على النقيض من هذا، الجيش الشعبي الثوري القياسات تعتمد على التحليل الطيفي والتصوير خصيصا لتصميم المجسات باراماجنيتيك لتوفير دقة الوظيفية. علما بأن تحقيقات الجيش الشعبي الثوري خارجية تتمتع بميزة خارجية يسبر الرنين المغناطيسي النووي نظراً لحساسية الجوهرية أعلى كثيرا من المنتجين وغياب إشارات الجيش الشعبي الثوري الخلفية الذاتية. وضع مؤخرا وظيفة مزدوجة الرقم الهيدروجيني والأكسدة والاختزال نيتروكسيل التحقيق11 وترتيل متعدد الوظائف مسبار12 يوفر فرصاً غير مسبوقة في فيفو القياسات المتزامنة من عدة TME المعلمات وبهم علاقة تحليلات مستقلة في توزيع المسبار والوقت لقياس. على حد علمنا، هناك لا أساليب أخرى متاحة لتقييم في فيفو الناحية الفسيولوجية الكيميائية TME المعالم الهامة في المواضيع المعيشية، مثل فس2، الرقم الهيدروجينيهوبي، والأكسدة والاختزال والمدفع جريازيف في نفس الوقت.
تحقيقات عن في فيفو القياسات الوظيفية:
ويبين الشكل 1 التركيبات الكيميائية لتحقيقات باراماجنيتيك المستخدمة للوصول المعلمات TME، التي تشمل تحقيقات الجسيمات وقابل للذوبان. حساسية فنية عالية، والاستقرار في الأنسجة الحية، والحد الأدنى من السمية هي بعض الفوائد التي تجعل الجسيمات المسابير المفضل عبر المسابير القابلة للذوبان في فيفو oximetry الجيش الشعبي الثوري. على سبيل المثال، زادت المسابير الجسيمات مرات الاحتفاظ في موقع زرع الأنسجة القابلة للذوبان المسابير السماح للقياس الطولي للنسيج فس2 على مدى عدة أسابيع بالمقارنة. من ناحية أخرى، يتفوق المسابير القابلة للذوبان المسابير الجسيمات بتوفير القياسات المكانية حلها باستخدام الجيش الشعبي الثوري على أساس تقنيات التصوير فضلا عن السماح بتحليل ما يصاحب ذلك من وظائف متعددة (فس2، ودرجة الحموضة، Pi، الأكسدة والاختزال، و المدفع جريازيف).
الشكل 1. التركيبات الكيميائية لتحقيقات باراماجنيتيك أن تجميع TME تقييم مقايسة. وهذا يشمل الجسيمات فس2 التحقيق اللغوي-المعلومات (R =-O (الفصل2)3CH3)، والمسابير القابلة للذوبان: وظيفة مزدوجة الرقم الهيدروجيني والأكسدة المسبار، المجلة؛ مسبار المراعية للمدفع جريازيف، رسر؛ ومتعددة الوظائف فس2ودرجة الحموضة والتحقيق Pi المكروية خارج الخلية، المسبار الأمل. قد وصفت توليف هذه المسابر في المراجع المتوفرة 11،12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Protocol
Representative Results
Discussion
تسمح أساليب عرض موسع في فيفو التقييم للمعلمات حرجة من TME الكيميائية، أي فس2، ودرجة الحموضة، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات بي الخلالي والمدفع جريازيف داخل الخلايا. تقنيات الرنين المغناطيسي، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي ومنخفضة-ميدان الجيش الشعبي الثوري، هي أساليب ال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها جزئيا في المعاهد الوطنية للصحة منح CA194013 و CA192064 و U54GM104942. من المسلم به وفكتسي لبدء ففك، AB، و TDE. يشكر المؤلفون جينشيفا م. د. و. ك. شتاينبرجر للمساعدة مع تجارب توضيحية. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| L-band EPR spectrometer | Magnettech, Germany | L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules | |
| Temperature & Gas Controller | Noxygen, Germany | Temperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition | |
| Sonicator | Fisher Scientific | ||
| GSH (L-Glutathione reduced) | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| MMTV-PyMT mice | In house | ||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Met-1 murine breast cancer cells | In house | ||
| C57Bl/6 wild type mice | Jackson Laboratory | ||
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypan Blue Exclusion Dye | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Ohmeda Fluotec 3 | |||
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott Laboratories | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic | sigma-Aldrich | S07051 | |
| Sodium Chloride | sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric acid | sigma-Aldrich | 320331 | |
| Sodium Hydroxide | sigma-Aldrich | S8045 | |
| Glucose | sigma-Aldrich | ||
| Glucose oxydase | sigma-Aldrich | ||
| Lauda Circulator E100 | Lauda-Brikmann | ||
| pH meter Orion | Thermo Scientific | ||
| LiNc-BuO probe | In house | The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13 | |
| NR probe | In house | The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11 | |
| RSSR probe | In house | The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15 | |
| HOPE probe | In house | The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12 |
Riferimenti
- Siemann, D. W. . Tumor Microenvironment. , (2011).
- Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
- Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).
- Haulica, A., Ababei, L. Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours. Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).
- Matsumoto, K., et al. High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).
- Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).
- Voegtlin, C., Thompson, J. W. Glutathione content of tumor animals. J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).
- Bobko, A. A., et al. Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression. Sci Rep. 7, 41233 (2017).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).
- Gade, T. P., et al. Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors. Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).
- Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques. JACS. 135, 5904-5910 (2013).
- Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
- Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models. Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).
- Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
- Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe. Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).
- Khramtsov, V. V., Zweier, J. L., Hicks, R. . Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , 537-566 (2010).
- Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment). Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).
- Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. . Practical NMR spectroscopy. , (1980).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Eubank, T. D., et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).
- Khramtsov, V. V., et al. Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method. Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).
- Komarov, D. A., et al. Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes. Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).
- Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin. Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).
- Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment. Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).
- Samouilov, A., et al. In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe. Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).
- Goodwin, J., et al. In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation. NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).
