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Neuroscienze

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Published: November 17, 2017
doi:
10.3791/56675
, , , ,
1Department of Biology,James Madison University

Summary

Zelle-autonome Funktionen der Gene im Gehirn können durch Induktion Verlust studiert werden oder der Funktion in geringer Dichte Bevölkerungen der Zellen gewinnen. Hier beschreiben wir in Utero Elektroporation Cre-Rekombinase in spärlichen Bevölkerung kortikale Neuronen mit Floxed Genen zu entwickeln, Verlust der Funktion in Vivozu liefern.

Abstract

Zelle-autonome neuronale Funktionen der Gene können aufgedeckt werden, indem Sie verursachen Verlust oder Gewinn der Funktion eines Gens in einer kleinen und spärlich Population von Neuronen. Dazu muss erzeugen ein Mosaik in die Neuronen mit Verlust oder Gewinn der Funktion eines Gens von genetisch unbeirrt Gewebe umgeben sind. Hier verbinden wir das Cre-Lox-Rekombinationssystem mit in Utero Elektroporation um Mosaik Hirngewebe zu generieren, die verwendet werden, um die Zelle-autonome Funktion von Genen in Neuronen zu untersuchen. DNA-Konstrukte (erhältlich über Repositories), Codierung für eine fluoreszierende Label und Cre-Rekombinase werden in kortikalen Neuronen mit Genen flankiert mit LoxP-Sites in den Gehirnen von Mäuseembryonen in Utero mit Entwicklung eingebracht Elektroporation. Darüber hinaus beschreiben wir verschiedene Anpassungen, die in Utero Elektroporation-Methode, die Überlebensfähigkeit und Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Diese Methode erfordert auch einen Titer für Cre-vermittelten Rekombination in einer spärlich oder Dichte Bevölkerung der Neuronen. Histologische Präparate von beschrifteten Hirngewebe nicht erforderlich (aber kann angepasst werden) Immunohistochemistry. Die Konstrukte verwendet garantieren, dass das Eindringmittel Neuronen tragen das Gen für Cre-Rekombinase beschriftet. Histologische Präparate können morphologische Analyse von Neuronen durch konfokale Bildgebung der dendritischen und axonalen Lauben und dendritischen Dornen. Weil Verlust oder Gewinn der Funktion im spärlich Mosaik Gewebe erreicht wird, erlaubt diese Methode das Studium der Zelle-autonome Notwendigkeit und Angemessenheit der Gen-Produkte in Vivo.

Introduction

Generierung von einem genetischen Mosaik ist ein klassischen experimentellen Paradigma zum Verständnis der Funktion eines Gens von Interesse. Um festzustellen, ob ein Gen für eine zelluläre Phänotyp notwendig ist, ist der einfachste Ansatz einen Verlust der Funktion des Gens in den Organismus (z.B. Ko) verursacht. Um festzustellen, ob ein Gen gezielt in einem bestimmten Zelltyp benötigt wird, ist jedoch nicht KO des Gens in den Organismus ein gültiger Ansatz. Stattdessen eine Methode ist erforderlich, dadurch wird den Verlust der Funktion eines Gens in einer bestimmten Zelle während von Wildtyp (d. h. genetisch unbeirrt) Gewebe umgeben ist – in anderen Worten, Mosaik Gewebe zu schaffen. Wenn die mutierte Zelle einen mutierten Phänotyp zeigt, aber umgebenden Wildtyp-Zellen nicht, der Genfunktionen Zelle-autonom. Analyse der Mosaik-Gewebe, in dem Wildtyp Gewebe, mutierte Zellen umgeben sind eignet sich für das Verständnis der Zelle-autonome Funktionen der Gene, vor allem im Gehirn, wo Neuronen und Glia eine große Verbundnetz des Gewebes bilden.

Verschiedene Formen von Mosaik Hirngewebe lieferten leistungsstarke Modelle um Zelle-autonome Funktionen der Gene zu untersuchen. Studien konzentrierten sich auf neuronale Transplantation1weiblichen X-chromosomal Mosaikbildung2,3,4, und endogenen somatische Mosaikbildung5,6 haben ihre Schlußfolgerungen basierend auf Mosaik Hirngewebe. Bedingte Löschung eines Gens durch die Cre Lox Rekombinationssystem ist eine Methode, die die große Verfügbarkeit der transgene Mauslinien nutzt. Bei dieser Methode werden zwei LoxP-Standorten eingeführt, auf beiden Seiten einer erforderlichen Sequenz eines Gens (z. B. ein Exon), flankiert von LoxP-Websites, die beide in die gleiche Richtung (“Floxed”) stehen lassen. Cre-Rekombinase beschneidet die Reihenfolge zwischen den LoxP-Websites-7. CRE-vermittelten Rekombination kann durch Kreuzung Floxed Mäuse mit einer anderen Mauslinie mit dem Ausdruck Cre-Rekombinase zusammen mit einem fluoreszierenden Marker in einer Teilmenge von Zellen (“Cre-Reporter-Linie”) erreicht werden. Dies wurde in einer Vielzahl von Möglichkeiten, um die Funktionen eines Gens in Teilmengen von Zellen, wie z. B. exzitatorischen Neuronen oder Astrozyten8aufzudecken nachgewiesen. CRE-Reporter Linien CreERT2 Cre-vermittelten Rekombination sein Medikament-induzierbaren (Single Neuron Etikettierung mit induzierbaren Cre-vermittelten Ko oder glatt) ermöglichen ausdrücken können9. In eine andere Strategie als Mosaik-Analyse mit doppelter Marker (MADM)10,11ermöglicht Cre-vermittelten interchromosomal Rekombination eine homozygote Mutante neben heterozygot Gewebe geschaffen werden. In diesen Ansätzen muss eine neue Linie von Mäusen produziert werden jedes Mal für jeden Kandidaten-gen oder zellulären Subtyp, der überprüft wird. Alternativ kann Cre-Rekombinase postnatal durch Iontophorese12 oder durch virale Vektoren (z.B. Adeno-assoziierten Viren13 oder Lentiviren14 mit zellulären Subtyp-spezifische eingeführt werden Promotoren). Diese Strategie schafft starke und postnatale beschriften. Zu dünn und pränatal zerebrale kortikale Neuronen entwickeln, ist eine ideale Strategie in Utero Elektroporation Cre-Rekombinase mit einem fluoreszierenden Marker.

Neben der Kombination von Cre Lox Rekombination durch in Utero Elektroporation produzieren Mosaik Gewebe in Vivo, mehrere Anpassungen stellen wir Verfahren aus anderen veröffentlichten Protokolle15,16, 17,18,19,20,21. Wir geben Informationen zum Erfolg in der Zucht timed-trächtige Weibchen zu verbessern. Auch beschreiben wir unsere zwei Strategien einzuführen, spärlich und hellen Kennzeichnung von Neuronen im kortikalen Gewebe: eine Strategie ist, die Ebenen von einem einzigen Konstrukt Codierung für Cre-Rekombinase und einem fluoreszierenden Marker22titrieren. Eine weitere Strategie ist das “Supernova”-System, speziell mit diesen Parametern im Geist23,24verwenden. Darüber hinaus bieten wir Verbesserungen auf die Herstellung von konsistenten Mikroinjektion Pipetten und Vereinfachungen, die in Utero Elektroporation Chirurgie. Zu guter Letzt erläutern wir wichtige Schritte in einem vereinfachten histologischen Präparat, das die Analyse von dendritischen Dornen und dendritischen und axonalen Dorne, ohne weitere Färbung oder Immunohistochemistry ermöglicht.

Protocol

Hier beschriebene Methoden von Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) von James Madison University genehmigt worden und sind in Übereinstimmung und die Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Richtlinien. (1) Maus-Setup Ein junges Haus (> P60) männliche und weibliche homozygot Floxed Maus zusammen, um einen Züchter paar25einzurichten.Hinweis: Eine gute Negativkontrolle ist ein paar zusätzliche Züchter von Wildtyp-Mäusen, einger…

Representative Results

Die einzelnen Konstrukt GFP. CRE (siehe Materialliste) war elektroporiert bei E15.5 und visualisiert auf P14. Abhängig von der Konzentration des Konstrukts und das Volumen der Injektion erhalten Sie ein spärliches oder dichtes Ergebnis22,26. Beispiel: Injektion von 1 µL von 2 mg/mL GFP. CRE-Ergebnisse in eine spärliche Verteilung der markierten Zellen, von die einige helle (Abbildung 1A) und lokal…

Discussion

Hier stellen wir die Kombination von in Utero Elektroporation mit Cre-Rekombinase bei Floxed Mäusen, Mosaik Hirngewebe zu generieren. Ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass eine neue Mauslinie muss nicht jedes Mal generiert werden ein verschiedenen zellulärer Subtyp wird ins Visier genommen werden: in Utero Elektroporation kann verwendet werden, um exzitatorischen Neuronen, hemmende Neuronen oder Gliazellen je nach Ziel und Lage der Elektroporation15,<sup class="xref"…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken die großzügige Unterstützung der James Madison University Department of Biology und James Madison Universität Licht Mikroskopie und Imaging Facility. Dr. Mark L. Gabriele für hilfreiche Ratschläge zur Vorbereitung junger postnatale Gewebe, und DRS. Justin W. Brown und Corey L. Cleland für großzügige Koordinierung der chirurgischen Materialien und Raum. Diese Forschung wurde teilweise durch ein Collaborative Research Grant durch 4-VA, eine partnerschaftliche Zusammenarbeit zur Förderung der Commonwealth von Virginia (etfolgreich) und durch eine Virginia Akademie der Wissenschaft kleine Projekt Research Grant (etfolgreich) finanziert. Unterstützung hat wurde großzügig zur Verfügung gestellt von einer Betty Jo liebevolle Butler 58 Stiftung für Undergraduate Research Stipendium (K.M.B), ein Sommer-Forschungsstipendium Farrell (auf K.M.B), ein James Madison Universität zweiten Jahrhundert Stipendium (K.M.B), ein James Madison University Centennial Stipendium (C.J.H.), ein James Madison Universität Lucy Robinson Suche 30 Memorial Stipendium (Z.L.H.) und ein James Madison University College von Wissenschaft und Mathematik Fakultät Hilfe gewähren (etfolgreich).

Materials

C57BL/6J mice The Jackson Laboratory #000664 See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice")
GFP.Cre empty vector AddGene #20781 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #69138 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova) AddGene #69136 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #85006 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen #12362 See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit")
Trypan Blue powder, BioReagent grade Sigma T6146-5G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue")
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg VWR BDH9286-2.5KG See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl")
Potassium Chloride, ACS, 500 g VWR #97061-566 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl")
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich S0876-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4")
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich P5379-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL Fisher Scientific A144-500 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl")
P-97 Micropipette Puller Sutter Instrument P-97 See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
3.0 mm wide trough filament Sutter Instrument FT330B See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID World Precision Instruments TW100-4 See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" Phenix LW-8148 See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1×2 Teeth World Precision Instruments #14140 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps")
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503708-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503728-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps")
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply Medrepexpress #2204-c See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges")
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID World Precision Instruments #503203 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm Sigma-Aldrich CLS3160102-12EA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes")
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" Amazon B007SHGAHA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray")
Platinum Tweezertrode, 5 mm BTX #45-0489 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes")
ECM 830 Foot Pedal BTX #45-0211 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal")
ECM 830 Generator BTX #45-0052 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator")
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box Harvard Apparatus #72-6468 See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber")
Ophthalmic ointment Hanna Pharmaceutical Supply Co #0536108691 See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment")
Space Gel (AIMS) VWR #95059-640 See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution")
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula Veet #062200809951 See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) Phenix Research Products TSP-10LKIT See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip")
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177 See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly")
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" Medrepexpress MV-J397 See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures")
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive Medrepexpress VG3 See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive")
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL Sigma-Aldrich Z551546-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. Sigma-Aldrich Z192392-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle")
Nestlets Nesting Material Ancare NES3600 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials")
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile Bio-Serv S5137 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds")
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313 See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA")
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips World Precision Instruments #501976 See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers")
Agar powder Alfa Aesar #10752 See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar")
Single-edge razor blades, #9 blade Stanley Tools #11-515 See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade")
Specimen disc S D 50 mm Leica #14046327404 See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc")
Buffer tray S assembly Leica #1404630132 See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray")
VT1000 S Vibratome Leica #14047235612 See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome")
Double Edge Razor Blades Personna BP9020 See "5. Histology" (step 5.10 "blade")
Knife Holder S Leica #14046230131 See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder")
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set Amazon B0089KU6XE See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush")
Superfrost Plus Slides Electron Microscopy Services #71869-11 See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml Thermofisher P36970 See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 Phenix Research Products MS1415-10 See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI")
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope")
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon TE2000/C2si See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope")
4x objective, NA = 0.20 Nikon CFI Plan Apo Lambda 4X See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective")
20x objective, NA = 0.75 Nikon CFI Plan Apo Lambda 20X See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective")
60x objective, NA = 1.40 Nikon CFI Plan Apo VC 60X Oil See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective")
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Riferimenti

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Keywords: Cre-lox RecombinationMouse Cerebral CortexIn Utero ElectroporationGenetic MosaicNeurobiologyLayer 2-3 Cortical NeuronsPipette PreparationEmbryonic Day 15.5AnesthesiaMouse Surgery
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Bland, K. M., Casey, Z. O., Handwerk, C. J., Holley, Z. L., Vidal, G. S. Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (129), e56675, doi:10.3791/56675 (2017).
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